DNA測序的方法有很多種.目前最常見的是雙脫氧終止法了.在測序用的緩沖液中含有四種dNTP及聚合酶.測序時分成四個反應,每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A,C,G,T核苷三磷酸(稱為ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP),然后進行聚合反應.在第一個反應物中,ddATP會隨機地代替dATP參加反應一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈,由于其3位的羥基變成了氫,所以不能繼續(xù)延伸.所以第一個反應中所產生的DNA鏈都是到A就終止了; 同理第二個反應產生的都是以C結尾的; 第三個反應的都以G結尾,第四個反應的都以T結尾,電泳后就可以讀出序列了.也許這樣說你不一定明白.舉一個例子,假如有一個DNA,互補序列是GATCCGAT,我們試著做一下:
在第一個反應中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三個堿基時沒什么問題,但遇到A時,摻入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一個如果參與反應的是ddATP則終止,產生一個僅有2個核苷酸的序列:GA,否則繼續(xù)延伸,可以產生序列GATCCG,又到了下一個A了.同樣有兩種情況,如果是ddATP摻入,則產生的序列是GATCCGA,延伸終止,否則可以繼續(xù)延伸,產生GATCCGAT.
所以在第一個反應系統(tǒng)中產生的都是以A結尾的片段:
GA,GATCCGA,
同理在第二個反應中產生的都是以C結尾的片段:
GATC,GATCC,
在第三個反應中產生的都是以G結尾的片段:
G,GATCCG
在第四個反應中產生的都是以T結尾的片段:
GAT,GATCCGAT,
電泳時按分子量大小排列,A反應的片段長度為2,7; C反應的為4,5; G反應的為1,6; T反應的為3,8,四個反應的產物分別電泳,結果為
8 7 6 5 4 3 2 1
A | |
C | |
G | |
T | |
我們可以從右向左讀,為GATCCGAT,至此,測序完成(上面這個圖在百度知道中顯示不正常,因為百度知道的網(wǎng)頁用的是比例字體,你如果想看它,拷貝到記事本中,用等寬的字體來看).