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  • 幾種細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理和特點(diǎn)分析

    幾種細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理和特點(diǎn)分析
    生物人氣:149 ℃時(shí)間:2020-09-15 03:26:07
    優(yōu)質(zhì)解答
    轉(zhuǎn)染方法的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大,不少轉(zhuǎn)染方法都需對(duì)細(xì)胞數(shù)量,DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例,培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化.傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù),如DEAE右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法,脂質(zhì)體法各有利弊,其主要原理及應(yīng)用特點(diǎn)見下表:轉(zhuǎn)染方法原理應(yīng)用特點(diǎn)磷酸鈣法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染\x0d瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染不適用于原代細(xì)胞\x0d操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差\x0d有些細(xì)胞不適用DEAE-右旋糖苷法帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù)\x0d但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用\x0d轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位,DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞適用性廣但細(xì)胞致死率高,DNA和細(xì)胞用量大,需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件病毒介導(dǎo)法通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等逆轉(zhuǎn)錄病毒 特定宿主細(xì)胞但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期\x0d需考慮安全因素腺病毒通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染\x0d特定宿主細(xì)胞可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞\x0d需考慮安全因素陽(yáng)離子脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清.轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞,DNA在胞內(nèi)逐步釋放,表達(dá)瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染可用于:人的表皮細(xì)胞,纖維原細(xì)胞,淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核穩(wěn)定轉(zhuǎn)染\x0d瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限\x0d多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎細(xì)胞 除上述傳統(tǒng)方法外,近年來國(guó)際上推出了一些陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù),以其適用宿主范圍廣,操作簡(jiǎn)便,對(duì)細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞.其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI) 的轉(zhuǎn)染性能最佳,但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性,且其合成工藝復(fù)雜.聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽(yáng)離子電荷密度的有機(jī)大分子,每相隔二個(gè)碳個(gè)原子,即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子,使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體.這種聚陽(yáng)離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞,其效果好于脂質(zhì)聚酰胺,經(jīng)進(jìn)一步的改性后,其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物,而且它的細(xì)胞毒性低.大量實(shí)驗(yàn)證明,PEI是非常有希望的基因治療載體.目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí),PEI 經(jīng)常做為核心組成成分.線型PEI(Line PEI,LPEI) 與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI(Branched PEI,BPEI) 要早一些,過去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件,LPEI/DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低,有利于細(xì)胞定位,因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些.但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,從而提高轉(zhuǎn)染效率,但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大.超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低,但轉(zhuǎn)染效率卻較高.GenEscort 是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI 與各種含有生理?xiàng)l件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián),合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物.
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