PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù).
　　溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三溫度點(diǎn).在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100～300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）.
　?、僮冃詼囟扰c時(shí)間：變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因.一般情況下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間,但溫度不能過(guò)高,因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響.此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗.
　　②退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素.變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合.由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞.退火溫度與時(shí)間,取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長(zhǎng)度.對(duì)于20個(gè)核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想.引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：
　　Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）
　　復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）
　　在Tm值允許范圍內(nèi),選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,提高PCR反應(yīng)的特異性.復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合.
　　③延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　高于90℃時(shí),DNA合成幾乎不能進(jìn)行.
　　PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,常用溫度為72℃,過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合.PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時(shí)間1min是足夠的.4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min.延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn).對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增,延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些.
　　循環(huán)次數(shù)　　循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度.PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度.一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多.