PCR技術(shù)概論
http://shiyan.ebioe.com/PCRPE-CetusMullisTaqDNA_3.htm
(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù). 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定.過去幾天幾星期才能做到的事情,用PCR幾小時便可完成.PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑.
PCR技術(shù)簡史
PCR的最早設(shè)想 核酸研究已有100多年的歷史,本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù),Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性,與合適的引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”.
PCR的實現(xiàn) 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng).其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制,只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA ,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合適的緩沖體系,DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間.
PCR的改進與完善最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段,其缺點是：①Klenow酶不耐高溫, 90℃會變性失活,每次循環(huán)都要重新加.②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進行,容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配,其PCR產(chǎn)物特異性較差,合成的DNA片段不均一.此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點,但由于Klenow酶不耐熱,在DNA模板進行熱變性時,會導(dǎo)致此酶鈍化,每加入一次酶只能完成一個擴增反應(yīng)周期,給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難.這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視.
1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR,其擴增的DNA片段很均一,真實性也較高,只有所期望的一種DNA片段.但每循環(huán)一次,仍需加入新酶.
1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶. 此酶具有以下特點：①耐高溫,在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%,在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%,在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%.②在熱變性時不會被鈍化,不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶.③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率,增加了擴增長度(2.0Kb).由于提高了擴增的特異性和效率,因而其靈敏性也大大提高.為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別,將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase).此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用.
PCR技術(shù)的基本原理
PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物.PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板.每完成一個循環(huán)需2～4分鐘, 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍.
. 到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝
PCR的反應(yīng)動力學(xué)PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行,使DNA擴增量呈指數(shù)上升.反應(yīng)最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算.Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù),X表示平(Y)均每次的擴增效率,n代表循環(huán)次數(shù).平均擴增效率的理論值為100%,但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值. 反應(yīng)初期,靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式,隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,被擴增的DNA 片段不再呈指數(shù)增加,而進入線性增長期或靜止期, 即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” ,這種效應(yīng)稱數(shù)、PCR 擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素.大多數(shù)情況下,平臺期的到來是不可避免的.
PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分.短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5'端之間,是需要擴增的特定片段.短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的,以一個原始模板為例,在第一個反應(yīng)周期中, 以兩條互補的DNA為模板,引物是從3'端開始延伸, 其5'端是固定的,3' 端則沒有固定的止點,長短不一,這就是“長產(chǎn)物片段”.進入第二周期后,引物除與原始模板結(jié)合外,還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合.引物在與新鏈結(jié)合時, 由于新鏈模板的5'端序列是固定的, 這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點, 保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”.不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加, 而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加, 幾乎可以忽略不計, 這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化,就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用.
PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
標準的PCR反應(yīng)體系：
10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物各10～100pmol
模板DNA0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至100ul
PCR： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、、模板和2+
： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度.理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增.
設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度： ,常用為左右.
②引物擴增跨度： 以為宜,特定條件下可擴增長至的片段.
③引物堿基：含量以為宜,太少擴增效果不佳,過多易出現(xiàn)非特異條帶.最好隨機分布,避免個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補,特別是端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶.
⑤引物端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗.
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處.
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性.
引物量： 每條引物的濃度.～或～,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會.
目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng), 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量.指總反應(yīng)體積為時,濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少.
的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系,粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性.溶液呈酸性,使用時應(yīng)配成高濃度后,以或.的緩沖液將其調(diào)節(jié)到.～.,小量分裝, ℃冰凍保存.多次凍融會使降解.在PCR反應(yīng)中,應(yīng)為～,尤其是注意種的濃度要相等等摩爾配制,如其中任何一種濃度不同于其它幾種時偏高或偏低,就會引起錯配.濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量.能與2+結(jié)合,使游離的2+濃度降低.
模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用和蛋白酶來消化處理標本.的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸.提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng).一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴增.模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶法,要防止降解.
2+2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種濃度為時,2+濃度為.～.為宜.濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少.
PCR反應(yīng)條件的選擇
PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù).
： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性退火延伸三個溫度點.在標準反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在～℃變性,再迅速冷卻至～℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至～℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對于較短靶基因長度為～時可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用℃變性,℃左右退火與延伸此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性.
①變性溫度與時間：變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因.一般情況下,℃～℃足以使模板DNA變性,若低于℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響.此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會導(dǎo)致PCR失敗.
②退火復(fù)性溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素.變性后溫度快速冷卻至℃～℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合.由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞.退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度.對于個核苷酸,含量約的引物,℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
在值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合, 提高PCR反應(yīng)的特異性.復(fù)性時間一般為～,足以使引物與模板之間完全結(jié)合.
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時, DNA合成幾乎不能進行.
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在～℃之間,常用溫度為℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合.PCR延伸反應(yīng)的時間,可根據(jù)待擴增片段的長度而定,一般以內(nèi)的DNA片段,延伸時間是足夠 的.～的靶序列需～；擴增需延伸至.延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn).對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些.
循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度.PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度.一般的循環(huán)次數(shù)選在～次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多.