PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù).
　　溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點.在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).
　?、僮冃詼囟扰c時間：變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因.一般情況下,93℃～94℃min足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響.此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會導(dǎo)致PCR失敗.
　?、谕嘶?復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素.變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合.由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞.退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度.對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)
　　復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合, 提高PCR反應(yīng)的特異性.復(fù)性時間一般為30～60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合.
　?、垩由鞙囟扰c時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　高于90℃時, DNA合成幾乎不能進(jìn)行.
　　PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合.PCR延伸反應(yīng)的時間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的.3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min.延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù).
　　溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點.在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).
　?、僮冃詼囟扰c時間：變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因.一般情況下,93℃～94℃min足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響.此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會導(dǎo)致PCR失敗.
　?、谕嘶?復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素.變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合.由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞.退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度.對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)
　　復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合, 提高PCR反應(yīng)的特異性.復(fù)性時間一般為30～60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合.
　?、垩由鞙囟扰c時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　高于90℃時, DNA合成幾乎不能進(jìn)行.
　　PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合.PCR延伸反應(yīng)的時間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的.3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min.延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù).
　　溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點.在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).
　?、僮冃詼囟扰c時間：變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因.一般情況下,93℃～94℃min足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響.此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會導(dǎo)致PCR失敗.
　　②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素.變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合.由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞.退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度.對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)
　　復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合, 提高PCR反應(yīng)的特異性.復(fù)性時間一般為30～60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合.
　?、垩由鞙囟扰c時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　高于90℃時, DNA合成幾乎不能進(jìn)行.
　　PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合.PCR延伸反應(yīng)的時間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的.3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min.延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn).對低濃度模板的擴(kuò)增,延伸時間要稍長些.