光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度,對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法.
在分光光度計(jì)中,將不同波長的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時(shí),便可得到與眾不同波長相對應(yīng)的吸收強(qiáng)度.如以波長（λ）為橫坐標(biāo),吸收強(qiáng)度（A）為縱坐標(biāo),就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線.利用該曲線進(jìn)行物質(zhì)定性、定量的分析方法,稱為分光光度法,也稱為吸收光譜法.用紫外光源測定無色物質(zhì)的方法,稱為紫外分光光度法；用可見光光源測定有色物質(zhì)的方法,稱為可見光光度法.它們與比色法一樣,都以 Beer-Lambert定律為基礎(chǔ). 上述的紫外光區(qū)與可見光區(qū)是常用的.但分光光度法的應(yīng)用光區(qū)包括紫外光區(qū),可見光區(qū),紅外光區(qū).
波長范圍
(1)200～400nm的紫外光區(qū),(2)400～760nm的可見光區(qū), (3)2.5～25μm(按波數(shù)計(jì)為4000cm～400cm)的紅外光區(qū).
儀器
紫外分光光度計(jì),可見分光光度計(jì)（或比色計(jì)）、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì).為保證測量的精密度和準(zhǔn)確度,所有儀器應(yīng)按照國家計(jì)量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定,定期進(jìn)行校正檢定.
編輯本段
基本原理
當(dāng)一束強(qiáng)度為I0的單色光垂直照射某物質(zhì)的溶液后,由于一部分光被體系吸收,因此透射光的強(qiáng)度降至I,則溶液的透光率T為:
根據(jù)朗伯(Lambert)-比爾(Beer)定律:
A=abc
式中A為吸光度,b為溶液層厚度（cm）,c為溶液的濃度（g/dm^3), a為吸光系數(shù).其中吸光系數(shù) 與溶液的本性、溫度以及波長等因素有關(guān).溶液中其他組分（如溶劑等）對光的吸收可用空白液扣除.
由上式可知,當(dāng)固定溶液層厚度l和吸光系數(shù) 時(shí),吸光度A與溶液的濃度成線性關(guān)系.在定量分析時(shí),首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況（吸收光譜）,從中確定最大吸收波長 ,然后以此波長 的光為光源,測定一系列已知濃度c溶液的吸光度A,作出A~c工作曲線.在分析未知溶液時(shí),根據(jù)測量的吸光度A,查工作曲線即可確定出相應(yīng)的濃度.這便是分光光度法測量濃度的基本原理.