DNA 純化
在生物技術實驗中,我們粗提取的DNA需分離純化去處蛋白質(zhì)等雜質(zhì),我們都需要將最終的結(jié)果在瓊脂糖凝膠, 或PAGE凝膠上走電泳觀察,以判斷我們實驗的正確性以及DNA片段的完整性.同時通過紫外分光光度計測定OD260,OD280的吸收值,以確定DNA的濃度和純度.
核酸經(jīng)凝膠電泳后,在EB（溴化乙錠）中浸染,核酸分子與溴化乙錠結(jié)合后, 能吸收300-360mm波長的紫外光,同時誘發(fā)出液長為590nm的紅橙色熒光,從而可通過照像機攝影,凝膠成像系統(tǒng)記錄實驗結(jié)果.DNA濃度的計算根據(jù)郎伯-比爾定理（E=abc）計算.根據(jù)經(jīng)驗1OD260=0.05ug/ul DNA.DNA純度的判斷根據(jù)OD260/OD280的比值判斷,符合要求純度高的純化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之間,低于此范圍表明蛋白質(zhì)含量超標,高于此范圍表明樣品中含有RNA.
實驗試劑及器材
酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）
70％乙醇TE buffer
RNase
瓊脂糖
TBE電泳緩沖液
電泳設備
紫外分光光度計
凝膠成像系統(tǒng)
1. 加入RNase至終濃度10μg/ul 37℃反應1小時.
2. 加入酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）等體積各抽提2-3次,取上清.
3. 加入1/10倍體積3M NaAc(pH5.2),2倍體積無水乙醇混勻,－20℃下10min-30min.
4. 15000rpm,離心10分鐘.
5. DNA沉淀用70％乙醇洗2次, 37℃烘干DNA（無乙醇）.
6. 100μl TE buffer溶解沉淀
7取20ul DNA母液稀釋至1000μl,在紫外分光光度計上測OD260,OD280.
8.取10 ul DNA, 在 0.8％瓊脂糖凝膠120伏,1-2小時電泳,
9.在凝膠成像系統(tǒng)上記錄和分析結(jié)果.
DNA 連接
DNA分子的體外連接就是在一定條件下, 由DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段組鄰的5’端磷酸與3’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學過程, DNA分子的連接是在酶切反應獲得同種酶互補序列基礎上進行的.
帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中,但是在連接反應時,外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物.因此,必須仔細調(diào)整連接反應中兩個DNA 的濃度,以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達到最佳水平,此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團以抑制載體DNA的自身環(huán)化.利用T4 DNA連接酶進行目的DNA和載體的體外連接反應,也就是在雙鏈DNA 5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價鍵.如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷）,可形成4個新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷,則只能形成2個新的磷酸二酯鍵,此時產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個單鏈缺口,在導入感受態(tài)細胞后可被修復.
1、 不對稱粘性末端：兩種限制酶消化后,需純化載體以提高連接效率；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點?？杀Ａ簦环侵亟M克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中.
2、 對稱性粘性末端；線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點常可保留；重組質(zhì)粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；外源DNA會以兩個方向插入到載體中.
3、 平端：要求高濃度的DNA和連接酶；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點消失；重組質(zhì)粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；非重組克隆的背景較高 .
粘性末端連接：
實驗試劑：
用適當?shù)南拗泼赶|(zhì)粒和外源DNA.如有必要,可用凝膠電泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒DNA.通過酚：氯仿抽提和乙沉淀來純化DNA,然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml.
10×T4DNA連接酶buffer（該緩沖液應分裝成小份,貯存于－20℃.）：200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；50mM二硫芐糖醇；
500μl/mlBSA（可用可不用）
T4DNA連接酶
5mMATP
實驗步驟：
1、 在無菌Eppendorf管中加入以下溶液：
1) 10μl體積反應體系中：取載體50-100ng,加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為1∶1-1∶5）,補足ddH2O 至8μl.
2) 輕輕混勻,稍加離心,于45℃水浴5分鐘使重新退火的粘端解鏈, 迅速將混合物轉(zhuǎn)入冰浴.
3) 加入含ATP的10×Buffer 1μl,T4 DNA連接酶合適單位, 用ddH2O 補至10μl.
2、 蓋上管蓋,充分混勻,臺式離心扣上離心5秒.
3、 12℃下過夜連接反應.
4、 反應結(jié)束后于－20℃保存.
5、 再設立兩個對照反應,其中含有（1）只有質(zhì)粒載體；（2）只有外源DNA片段.如果外源DNA量不足,每個連接反應可用50-100ng質(zhì)粒DNA,并盡可能多加外源DNA,同時保持連接反應體積不超過10μl.可用至少3種不同方法來測定T4噬菌體DNA連接酶的活性.
注意事項：
1、 連接反應的溫度：DNA連接酶的最適反應溫度為37℃,但在此溫度下, 粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定,折衷方法是12℃過夜.
2、 DNA的平未端和粘性末端：由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端,因而連接反應中就有平未端連接和粘性末端連接. 二者連接效率不同.粘性末端效率高,因而在底物濃度,酶濃度選擇上是有差異的.
3、 堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體：為了提高連接效率,一般采取提高DNA的濃度,增加重組子比例.這樣就會出現(xiàn)DNA自生連接問題, 為此通常選擇對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理,除去其5’末端的磷酸基,防止環(huán)化, 通過接反應后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細胞后得以修復.
4、 連接反應的檢測：連接反應成功與否,最后的檢測要通過下一步實驗,轉(zhuǎn)化宿主菌, 陽性克隆的篩選來確定.
5、 如果要檢驗連接酶和連接酶專用的緩沖液是否有效,可重新連接酶切后的λDNA.若連接成功,則說明有效.
原核表達
將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達.這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用.大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點：
易于生長和控制；用于細菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細胞系統(tǒng)的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇.但是,在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工,常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構(gòu)象.
表達載體在基因工程中具有十分重要的作用,原核表達載體通常為質(zhì)粒,典型的表達載體應具有以下幾種元件：
（1）選擇標志的編碼序列；
（2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動子；
（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子,核糖體結(jié)合位點)；
（4）一個多限制酶切位點接頭；
（5）宿主體內(nèi)自主復制的序列.
原核表達一般程序如下：
獲得目的基因－準備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉(zhuǎn)化表達宿主菌－誘導靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進一步檢測
真核表達
異源蛋白質(zhì)在細菌中表達是目前使用的主要的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng).大腸桿菌一直是最經(jīng)濟的系統(tǒng)之一.然而為了生產(chǎn)需要特異修飾、胞外分泌或有特異折疊需要的蛋白質(zhì),其他表達系統(tǒng)也是需要的.真核細胞在表達原核來源的基因、真核基因的cDNA拷貝或其他無內(nèi)含子的基因時可能表現(xiàn)很多特異問題.富含AT的基因在很多真核細胞中表達時會遭遇很劇烈的障礙.主要的真核信號序列如 加poly-A的位點、酵母轉(zhuǎn)錄終止位點和真核mRNA去穩(wěn)定序列都是富含AT的.內(nèi)含子序列也趨向于富含AT,盡管他們有參與剪切過程的很特異的識別序列.雖然絕大多數(shù)原核基因沒有剪切或聚腺苷過程,但這些真核過程需要的保守序列可能存在于原核基因中,因此當這些基因在真核細胞中表達時可能引起特異的問題.而且諸如哺乳動物和單子葉植物細胞的特異真核表達系統(tǒng)可能不能有效地表達無內(nèi)含子的基因.
真核mRNA在離開細胞核進而在胞漿的核糖體上被翻譯前需要特異的處理和修飾.這些過程包括去除內(nèi)含子、5'端甲基化帽子形成和3'端加poly-A.內(nèi)含子去除需要5'剪切位點、G75/G100U100A65AG65U保守序列、3'剪切位點、富含密啶NC66A100G100/G56保守序列和C72T98R77A100Y75保守序列.有效的加poly-A和mRNA剪切需要一個由兩個部分組成的信號：加poly-A保守序列AAUAAA和在切割位點內(nèi)的50個堿基的富含GT的序列.酵母真核轉(zhuǎn)錄終止序列（幾個不同的富含AT序列,如含TTTTTATA,TATATA,TACATA,TAGTAGTA的一個38bp區(qū)域）被研究的最清楚.這些結(jié)果來自對酵母突變體CYCI mRNA的mRNA水平和相對長度的確定的實驗.近期用in vivo質(zhì)粒穩(wěn)定性分析的研究結(jié)果證明：TATATA似乎和原始的38bp野生型區(qū)域一樣有效地終止轉(zhuǎn)錄,而TAGATATATATGTAA和TACATA效率差些,TTTTTTTATA幾乎沒有效率.所有這些序列在反方向時沒有終止轉(zhuǎn)錄功能.不幸的是幾乎沒有其他真核表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄終止序列方面的信息.
內(nèi)含子對幾個哺乳動物基因的正常表達是必需的,包括Beta-球蛋白、SV40 late mRNA和二氫葉酸還原酶基因.單子葉植物細胞充分表達乙醇脫氫酶的cDNA拷貝、報告基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、Beta葡萄糖苷酸酶和其他缺乏內(nèi)含子的基因時也依賴內(nèi)含子.轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)引入內(nèi)含子可以通過未確定的轉(zhuǎn)錄后機制增強表達.（免疫球蛋白基因）內(nèi)含子可能也包含轉(zhuǎn)錄增強子,因此通過轉(zhuǎn)錄機制增強表達.\x0d2011/8/7 8:58:37