參照以下real-time PCR引物設(shè)計原則：
1.最好位于編碼區(qū)5’端的300-400bp區(qū)域內(nèi),可以用DNAman,Alignment 軟件看看結(jié)果.
2.產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)（自由能小于58.61KJ/mol）.
3.引物長度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大.
4.G+C含量在40%~60%之間,45-55％最佳.
5.堿基要隨機分布,盡量均勻.
6.引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補.
7.引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補.
8.引物5′端可以修飾.
9.3’端不要以A結(jié)尾,3′端不可修飾,而且要避開AT,GC rich的區(qū)域,避開T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個）.
10.引物3′端要避開密碼子的第3位.
11.引物整體設(shè)計自由能分布5‘端大于3’端,且3‘端自由能最好小于9KJ/mol.可用oligo 6 軟件進行比對看結(jié)果的情況.
12.做熒光定量產(chǎn)物長度80-150bp最好,最長是300bp.
13.引物設(shè)計避免DNA污染,最好跨外顯子接頭區(qū).
14.引物與非特異性擴增序列的同源性最好小于70％或者有8個互補堿基同源.
15.查看有無假基因的存在.假基因就是無功能的DNA序列,與需要擴增的目的片段長度相似.
16.TM值在55-63度之間.
17..引物與非特異性擴增序列的同源性最好小于70％或者有8個互補堿基同源.