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鎳柱分離純化
固定金屬離子親和柱主要用于金屬螯化離子.位于許多蛋白中的組氨酸殘基將會(huì)和許多金屬離子,例如鋅.銅,鎳,鐵等形成復(fù)合物.因此,該柱料能選擇性螯合一些具有組氨酸殘基的蛋白質(zhì).但是半胱氨酸和咯氨酸殘基也能和固定化金屬螯和.但是親和力比組氨酸要弱.所以,結(jié)合的強(qiáng)度是和緩沖液的PH和金屬離子決定的.
金屬螯和柱料主要是由亞氨基的乙酰乙酸成分耦聯(lián)瓊脂糖柱料,借助醚長(zhǎng)生7個(gè)原子的空間.
全部容量：24-30um的含有zn的干膠
柱料結(jié)構(gòu)：6%的高鉸鏈的瓊脂糖
柱料大?。?5-165um
平均微粒：90um
直流速度：25度/0.1MPa/30倍柱床/5厘米高度/每小時(shí)可達(dá)700厘米
最大壓強(qiáng)：0.3MPa
PH變化：長(zhǎng)期3-13
短期2-14
化學(xué)穩(wěn)定：通用含水緩沖液
0.01M鹽酸,1.0M NAOH,20%乙醇（保存7天）
物理性質(zhì)：可以忽略在PH或者離子變化下的體積變化
耐熱性能：121度下0.1M乙酸鈉作用半小時(shí)
金屬螯和柱料保存于事先填充于20%乙醇.所以要攪拌驅(qū)除20%乙醇溶液.換成去離子水.比例是25%去離子水和75%處理膠.
處理金屬螯和柱料：
1 平衡所有用到的材料于室溫.
2 攪拌金屬螯和柱料
3 倒水進(jìn)柱子,驅(qū)除氣體.用無離子水液封幾厘米.
4 將金屬螯和柱料連續(xù)倒進(jìn)柱子,用玻璃棒支撐柱壁防止氣泡形成.
5 然后立即用無離子水液封,裝上柱蓋,連接上泵.
6 打開柱子底部的開關(guān),然后調(diào)節(jié)泵的流速.通常是不超過0.3MPa的.
7 經(jīng)過一個(gè)穩(wěn)定的柱床填鴨后,維持填壓速度為3個(gè)柱床.
使用adaptor
1 經(jīng)過上溯填鴨后,關(guān)閉柱床下面開關(guān),移開上面的薄膜,小心的加上去離子水進(jìn)行液封.
2 一定角度插入adaptor,確保沒有氣泡.
3 確保所有的連接都沒有問題,柱子/泵/樣品接受器
4 傾斜插入活塞確保沒有氣泡和管道充滿液體.利用活泵正反向的流動(dòng)確保沒有氣泡.
5 固定adaptor,打開柱子開關(guān),開始緩沖液的流動(dòng).先以填鴨的速度直到柱床穩(wěn)定后.
固定金屬離子：
金屬螯和柱料通過水來螯和金屬的,避免發(fā)生沉淀在膠上.
1 確保柱子已經(jīng)平衡好.如果有必要可以洗2個(gè)柱床（去離子水）
2 選擇金屬離子和0.1-0.3M中弱性酸.例如鐵離子PH 3左右就好,避免形成沉淀和共沉.
3 加入一倍柱床的金屬離子溶液
45倍柱床的去離子水洗滌
5至少2倍柱床的平衡緩沖液
結(jié)合：
發(fā)生于PH5.5-8.5之間.最強(qiáng)反映發(fā)生于最后
初始緩沖液的選擇決定于金屬離子和樣品的結(jié)合性質(zhì).乙酸鈉或者磷酸鈉是比較好的緩沖液中不能使用EDTA或者檸檬酸鹽
最通用緩沖液：
0.01-0.2M磷酸鈉
0.05M乙酸鈉
強(qiáng)烈推薦加入0.15-0.5M NaCl用于防止離子交換.
通常如果不知道一個(gè)蛋白的結(jié)合能力,最好的就是使用鋅離子和中性的磷酸或者乙酸鹽,同時(shí)含有0.15-0.5M NaCl
去垢劑不會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)合能力
金屬離子的取代意味著蛋白發(fā)生了結(jié)合.這種現(xiàn)象可以通過顏色來決定
洗脫蛋白：（3種方法）
1 降低PH(一步或者分步),大部分蛋白溶解于PH4-6最終3-4是可容的.可選擇檸檬酸鹽,磷酸或者乙酸鹽.
2 逐步提高咪唑的濃度（0-0.5M）,梯度變化最好是在初始緩沖液的PH范圍.
3 加入EDTA或者EGTA可洗脫蛋白質(zhì).但是不是通用的.
利用離心或者重力作用純化組氨酸位點(diǎn)蛋白
通過上鎳進(jìn)行選擇性結(jié)合含有組氨酸位點(diǎn)蛋白,然后利用含有咪唑的緩沖液洗脫蛋白.
以下的實(shí)驗(yàn)是為了最大化將組氨酸位點(diǎn)蛋白結(jié)合到金屬螯和柱料,然后確保能夠洗脫下來.當(dāng)結(jié)合和洗脫的條件尚未明了時(shí),這些方法也是很好用的.
為了獲得高純度的蛋白,必須摸索咪唑的緩沖液在樣品上柱和洗脫時(shí)的濃度.通常使用10mM-500mM范圍的咪唑的緩沖液進(jìn)行剃度洗脫,然后通過收集和SDS-PAGE 蛋白電泳確定洗脫濃度.
為了純化不可容的含有his位點(diǎn)的蛋白質(zhì),（包含體）,可以在變性條件下進(jìn)行.利用8M尿素或者6M鹽酸呱進(jìn)行溶解蛋白.
樣品處理：
樣品要經(jīng)可能溶解,避免出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象,所以可以利用0.45uM慮膜過濾雜志
如果樣品時(shí)溶解于20mM磷酸緩沖液中（含有0.5M Nacl,PH7.4）,必須調(diào)整PH到7－8.
上柱前準(zhǔn)備：
洗柱料：
1 親柔震動(dòng)膠瓶充旋膠料
2 利用吸管吸出足量柱料用以純化目的.每毫升柱料可以吸納5毫克蛋白
3 500g 離心2－5分鐘,沉淀柱料.
4 小心去除上清
5 加入5倍體積去離子水,充分振蕩柱料.可以倒置來回5分鐘,不要機(jī)械攪拌.
6 再次500g 離心2－5分鐘,沉淀柱料.
7 再次小心去除上清
掛鎳：
1 加入0.5倍柱床體積0.1M硫酸鎳,充分振蕩柱料.可以倒置來回5分鐘,不要機(jī)械攪拌.
2500g 離心2－5分鐘,沉淀柱料.
3小心去除上清
洗柱：
1加入5倍體積去離子水,充分振蕩柱料,來回倒置5分鐘
2500g 離心2－5分鐘,沉淀柱料.
3小心去除上清
4 再洗兩次柱料（一共3×5柱床去離子水）
5 最后用一倍體積起始緩沖液充旋柱料（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）
利用離心來純化：
上樣：
1 在起始緩沖液中加入樣品,然后使整體膠濃度達(dá)到50％
2 親柔攪拌,室溫離心5－30分鐘,結(jié)合能力取決于蛋白和樣品濃度.
3 500g 離心2－5分鐘,沉淀柱料.
4 取出上清.部分用于SDS-PAGE 蛋白電泳
洗膠：
1 加入5倍體積起始緩沖液,攪拌5分鐘
2 500g 離心2－5分鐘,沉淀柱料.
3取出上清.部分用于SDS-PAGE 蛋白電泳
4再洗兩次柱料（一共3×5柱床起始緩沖液）.記得取出上清,部分用于SDS-PAGE 蛋白
電泳
洗柱：
1 加入2倍體積洗脫緩沖液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）攪拌5分鐘
2再次500g 離心2－5分鐘,沉淀柱料.
3再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脫緩沖液）.記得取出上清,部分用于SDS-PAGE 蛋白電泳,280nM吸光值,ELISA,WESTERN
利用流速和重力純化：
1 在柱子底部加上濾器
2 加水排氣
3 加柱帽,去除殘余水.推薦是最多2 Ml柱料就可以了
樣品結(jié)合：
1 倒膠進(jìn)入柱子
2 小心上樣,用波棒室溫?cái)嚢?－30分鐘
3 打開柱帽,收集流出峰用于分析
洗膠：
1 加入5倍體積起始緩沖液,收集流出液用于SDS-PAGE 蛋白電泳
2再洗兩次柱料（一共3×5柱床起始緩沖液）.記得取出上清,部分用于SDS-PAGE 蛋白
電泳
洗柱：
1 加上柱帽,加入2倍體積洗脫緩沖液（20mM Na2HPO4 /0.5MnaCl/10mM咪唑/PH7.4）攪拌5分鐘.打開柱帽,收集流出峰
2再洗四次柱料（一共5×2柱床洗脫緩沖液）.記得取出上清,部分用于SDS-PAGE 蛋白電泳,280nM吸光值,ELISA,WESTERN
注意：0.5M咪唑的280nM吸光值＝0.5
常見問題：
1 樣品太粘稠
答：核酸存在影響,可以繼續(xù)超聲,加入RNA酶至10ug/mlDNA酶至5ug/ml.然后冰浴1
0－15分鐘.或者也可以用注射器來回充旋.這樣可以防止堵塞柱料.
2 平衡時(shí)樣品洗脫了下來
答: 檢查PH和緩沖液成分,如果緩沖液成分不正確,EDTA加入,強(qiáng)還原劑加入,都會(huì)導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象出現(xiàn).
加大膠的量,如果膠料承載能力過頭,也繪出出現(xiàn)這現(xiàn)象.
準(zhǔn)備新鮮的柱料,如果柱料斷裂,也掛不上蛋白.
3 在洗脫液中不含有組氨酸蛋白
答：如果SDS-PAGE 蛋白電泳已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛋白存在于超聲液中
超聲可能不完全.可以用顯微鏡觀察超聲情況.AD260/280比值.（通常是超聲前將10mg/ml溶菌酶加入25mM Tris-HCL,PH6-8）,避免發(fā)泡以降解融合蛋白.
蛋白可能是是包含體,可以使用4－6M鹽酸呱或者4－8 M尿素溶解.
尿素溶解的可以進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳,鹽酸呱溶解的不可以進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳,必須換緩沖液.
洗脫液濃度太稀,可以加大咪唑濃度或者降低PH 來決定最佳洗脫條件如果在平衡前的洗柱發(fā)現(xiàn)了目的蛋白,證明起始緩沖液中的咪唑濃度太高,可適當(dāng)降低.
4 考馬氏亮藍(lán)或者銀染發(fā)現(xiàn)多條帶
答：加入蛋白激酶抑制劑.可能是蛋白降解.用凝血酶切割前必須去除絲氨酸蛋白酶抑制劑采用梯度咪唑來洗脫蛋白.在平衡洗脫液中加入10mM咪唑可以洗脫大量雜質(zhì)而不會(huì)洗脫融合蛋白.低于500mM咪唑可以洗掉絕大部分雜質(zhì).
在洗脫步奏往起始緩沖液加入去垢劑（2％TRITON x-100或者2％Tween20）50% 葡萄糖,20mM B-巰基乙醇.記得雜質(zhì)通常沒有特意結(jié)合能力,可以改變緩沖液來洗脫.
如果雜志和目的蛋白有相同結(jié)合能力,那就不能用于純化.因此可以使用別的純化系統(tǒng),例如含有GST尾巴就用谷胱甘肽瓊脂糖4B
柱料再生,清潔和保存
柱料再生：
1 使用0.05M EDTA,0.5M NaCl來洗脫鎳離子.然后用3柱床的0.5M NaCl來洗干凈EDTA
2如果是鐵離子可以用0.05M EDTA泡過夜
3 這一步可以洗脫上面未能洗脫的殘余結(jié)合蛋白
清洗柱料：
1 0.5倍柱床2M NaCl,反向洗脫10－15分鐘
2 1M NaOH洗1小時(shí)去除殘余蛋白
3 每一步都要用3倍柱床起始緩沖液清洗
4 4倍柱床70%乙醇洗脫強(qiáng)親水蛋白和脂類蛋白.
也可以使用2倍柱床去垢劑.0.1-0.5%非離子去垢劑溶于0.1M乙酸.浸泡1－2小時(shí).最后用5個(gè)柱床的70％乙醇去除去垢劑.
清潔：
1 盡可能去除微生物
2 0.5-1M NaOH反向流動(dòng)半小時(shí)
3 再用3－5倍柱床消毒的起始緩沖液平衡
4 這個(gè)清潔步奏不一定能夠提高純化能力
保存：
長(zhǎng)期保存于20％乙醇或者0.01M NaOH 于4度
以上來自百度文庫(kù),希望能幫到你.謝謝??！