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  • 過氧化氫酶的測定

    過氧化氫酶的測定
    生物人氣:465 ℃時間:2020-05-11 01:07:45
    優(yōu)質(zhì)解答
      使用過氧化氫酶檢測試劑盒是比較簡便的方法:
      過氧化氫酶檢測試劑盒(Catalase Assay Kit)是一種簡單易行的通過顯色反應(yīng)來檢測細(xì)胞、組織或其它樣品中過氧化氫酶
      (Catalase)活性的試劑盒.在過氧化氫相對比較充足的情況下,過氧化氫酶可以催化過氧化氫產(chǎn)生水和氧氣.殘余的過氧化
      氫在過氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物,產(chǎn)生紅色的產(chǎn)物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p-
      benzoquinonemonoimine),最大吸收波長為520nm.用過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,這樣就可以計算出樣品中的過氧化氫
      酶在單位時間單位體積內(nèi)催化了多少量的過氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)樗脱鯕?從而可以計算出樣品中過氧化氫酶的酶活力.
      Ø 過氧化氫酶分布非常廣泛.在肝臟、腎臟和紅細(xì)胞中,過氧化氫酶的水平非常高,這些器官和細(xì)胞是清除能導(dǎo)致氧化損傷的過氧
      化氫的主要場所.
      Ø 過氧化氫酶的活性也可以用紫外分光光度計測定A240,但蛋白質(zhì)或其它組份在A240附近都有比較強(qiáng)的吸收,會對測定產(chǎn)生嚴(yán)重干
      擾.因此,用紫外法測定過氧化氫酶的活性,比較適合純化的過氧化氫酶.本試劑盒通過檢測A520來測定過氧化物酶催化下由過
      氧化氫氧化生色底物產(chǎn)生的紅色產(chǎn)物,受干擾的因素小,檢測靈敏度高,可以檢測出低達(dá)1U/ml的過氧化氫酶.
      Ø 本試劑盒可以檢測全血、紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物、血清、組織勻漿產(chǎn)物、細(xì)胞裂解產(chǎn)物等生物樣品中的過氧化氫酶的活性.一個試劑盒
      共可以進(jìn)行100次檢測.
      使用方法:
      配制250mM過氧化氫溶液.本試劑盒提供的過氧化氫濃度約為1M.由于過氧化氫不是非常穩(wěn)定,使用前需自行測定過氧化氫的
      實際濃度.把濃度約為1M的過氧化氫用本試劑盒提供的過氧化氫酶檢測緩沖液稀釋100倍,使過氧化氫的濃度約為10mM.測定
      A240.
      過氧化氫(mM)=22.94XA240
      從而計算出本試劑盒提供的過氧化氫的實際濃度.然后再根據(jù)實際的過氧化氫濃度配制250mM過氧化氫溶液.
      b.配制5mM過氧化氫溶液.根據(jù)測定得到的實際過氧化氫濃度配制5mM過氧化氫溶液.
      c.配制顯色工作液.在冰浴上溶解顯色底物,適當(dāng)分裝后再使用,盡量避免反復(fù)凍融.其它試劑放置在冰浴上備用.取適當(dāng)量的過
      氧化物酶,按照1:1000的比例用顯色底物稀釋,配制成顯色工作液.例如取5微升過氧化氫酶,加入5ml顯色底物,混勻即得到
      5ml顯色工作液.
      2.樣品的準(zhǔn)備:
      用適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀饧?xì)胞或組織(可以使用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解).用本試劑盒提供的過氧化氫酶檢測
      緩沖液稀釋樣品,裂解好的樣品至少加入等體積的過氧化氫酶檢測緩沖液進(jìn)行稀釋.具體的稀釋倍數(shù)可以參考表1.
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