(一) 方法原理
樣品與硫酸一同加熱消化, 分解有機(jī)質(zhì), 釋放出的NH3 與硫酸結(jié)合成硫酸銨留在溶液中.在定氮消化瓶中,用氫氧化鈉中和硫酸銨生成氫氧化銨,加熱又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用標(biāo)定過的鹽酸或硫酸滴定, 從而計算出總氮量, 換算為蛋白質(zhì)量.
(二) 儀器、設(shè)備
1. 儀器
分析天平: 感量0.0001克；實驗用粉碎機(jī)；半微量凱氏蒸餾裝置；半微量滴定管, 容積10毫升；硬質(zhì)凱氏燒瓶: 容積25毫升, 50毫升；錐形瓶: 容積150毫升；電爐: 600瓦.
2. 試劑
(1) 鹽酸: 分析純, 0.02mol/L, 0.05mol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液(鄰苯二甲酸氫鉀法標(biāo)定)；
(2) 氫氧化鈉: 工業(yè)用或化學(xué)純, 40%溶液(W/V)；
(3) 硼酸: 分析純, 2%溶液(W/V)；
(4) 硼酸混合指示劑: 溴甲酚綠0.1克, 甲基紅0.1克分別溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升, 將混合指示劑與2%硼酸溶液按1:100比例混合, 用稀酸或稀堿調(diào)節(jié)PH值為4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置時間不宜過長, 需在1個月之內(nèi)使用；
(5) 加速劑: 五水合硫酸銅(分析純)10克, 硫酸鉀(分析純)100克在研缽中研磨, 仔細(xì)混勻, 過40目篩；
(6) 濃硫酸: 比重1.84, 無氮；雙氧水: 分析純,30%；蔗糖: 分析純；
(7) 雙氧水硫酸混合液(簡稱混液): 雙氧水、硫酸、水的比例為3:2:1, 即在100毫升蒸餾水中,慢慢加入200毫升濃硫酸, 待冷卻后, 將其加入300毫升30%雙氧水, 混勻, 此混液可一次配制500～1000毫升貯藏于試劑瓶中備用, 夏天最好放入冰箱或陰涼處貯藏, 室溫(20℃)上下時不必冷藏, 貯藏進(jìn)間不超過1個月 .
(三) 操作步驟
1. 樣品的選取和制備 選取有代表性的種子(帶殼種子需脫殼)挑揀干凈, 按四分法縮減取樣, 取樣量不得少于20克.將種子放于60～65℃烘箱中干燥8小時以上, 用粉碎機(jī)磨碎, 95%通過40目篩, 裝入磨口瓶備用.
2. 稱樣 稱取0.1克試樣兩份(含氮1～7毫克), 精確至0.0001克, 同時測定試樣的水分含量.
3. 消煮1 將試樣置開25毫升凱氏瓶中, 加入加速劑粉末.除水稻為1克外, 其它均為2克.然后加3毫升硫酸, 輕輕搖動凱氏瓶, 使試樣被硫酸濕潤, 將凱氏瓶傾斜置于電爐上加熱, 開始小火, 待泡沫停止后加大火力, 保持凱氏瓶中的液體連續(xù)沸騰, 沸酸在瓶頸中部冷凝回流.待溶液消煮到無微小的碳粒并呈透明的藍(lán)綠色時, 谷類繼續(xù)消煮30分鐘,豆類繼續(xù)消煮60分鐘.
4. 消煮2 將試樣置于50毫升凱氏瓶中, 加入0.5克加速劑和3毫升混液,在凱氏瓶上放一曲頸小漏斗, 傾斜在電爐上加熱, 開始小火(用調(diào)壓器將電壓控制在175伏左右), 保持凱氏瓶中液體呈微沸狀態(tài).5分鐘后加大火力(將電壓控制在200伏左右).保持凱氏瓶中液體連續(xù)沸騰, 消煮總時間, 水稻、高粱為30分鐘, 其它均為45分鐘.
注: 消煮中列入兩種消煮條件, 經(jīng)與國際谷物化學(xué)協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)法(ICC)比較, t值測驗均不顯著, 準(zhǔn)確度與精密度也基本一致,在具體工作中可根據(jù)實際情況取其一種.
5. 蒸餾 消煮液稍冷卻后加少量蒸餾水, 輕輕搖勻.移入半微量蒸餾裝置的反應(yīng)室中,用適量蒸餾水沖洗凱氏瓶4～5次.蒸餾時將冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示劑混合液的錐形瓶中, 向反應(yīng)室中加入40%氫氧化鈉溶液15毫升(如采用消煮2的條件, 加10毫升即可).然后通氣蒸餾, 當(dāng)餾出液體積約達(dá)50毫升時,降下錐形瓶.使冷凝管末端離開液面, 繼續(xù)蒸餾1～2分鐘, 用蒸餾水沖洗冷凝管末端,洗液均需流入錐形瓶中.
6. 滴定 谷類以0.02mol/L, 豆類以0.05mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸滴定至錐形瓶中的溶液由藍(lán)綠色變成灰紫色為終點.空白用0.1克蔗糖代替樣品作空白測定.消耗標(biāo)準(zhǔn)酸溶液的體積不得超過0.3毫升.
(四) 結(jié)果計算
式中:
V2 滴定試樣時消耗標(biāo)準(zhǔn)酸的體積(毫升)
V1 滴定空白時消耗標(biāo)準(zhǔn)酸的體積(毫升)
N標(biāo)準(zhǔn)酸溶液的濃度(mol/L)
K 氮換算成粗蛋白質(zhì)的系數(shù)
W 試樣重量(克)
X 試樣水分含量
0.0140每毫摩爾氮的克數(shù)
平行測定的結(jié)果用算術(shù)平均值表示,保留小數(shù)后二位.
兩份試樣粗蛋白質(zhì)的平行測定結(jié)果為15%以下時, 其相對相差不得大于3%；15%～30%進(jìn)為2%；30%以上為1%.
凱氏定氮法中的常量,微量,和半微量區(qū)別：
區(qū)別在于檢測用樣品量,你可以按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作,沒有必要拘泥于某一方法
主要看你樣品量是否足夠
1、常量由于可以把全部消化液一同蒸餾測定,故較適合蛋白質(zhì)含量低的樣品.
2、微量、半微量差別在裝置上,二者皆屬于水蒸汽蒸餾操作,只是前者把蒸汽直接導(dǎo)入反應(yīng)室內(nèi),后者把蒸汽導(dǎo)入反應(yīng)室外加熱,由于二者皆取消化液的一部份操作,可平行蒸餾操作,但檢測限要較常量法高.
3、純粹從回收率的角度看,半微量要稍好.