無明顯同源性.
引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會.
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng), 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少.
dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性.dNTP溶液呈酸性,使用時應(yīng)配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存.多次凍融會使dNTP降解.在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50～200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配.濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量.dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低.
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本. SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀 核酸.提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng).一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接 用于PCR擴增.RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜.Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少.
PCR反應(yīng)條件的選擇
PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù).
溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點.在標準反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).
①變性溫度與時間：變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因.一般情況下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性,若低于93℃則 需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響.此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會導(dǎo)致PCR失敗.
②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素.變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合.由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞.退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長 度.對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,提高PCR反應(yīng)的特異性.復(fù)性時間一般為30～60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合.
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時, DNA合成幾乎不能進行.
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合.PCR延伸反應(yīng)的時間,可根據(jù)待擴增片段的長度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的.3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min.延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn).對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些.
循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度.PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度.一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多.
PCR反應(yīng)特點
特異性強 PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性.
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵.引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的.聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度.再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高.
靈敏度高 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平.能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學(xué)中最小檢出率為3個細菌.
簡便、快速 PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2～4 小時完成擴增反應(yīng).擴增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣.
對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板.可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測. PCR擴增產(chǎn)物分析
PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增 ,其結(jié)果是否準確可靠,必須對其進行嚴格的分析與鑒定,才能得出正確的結(jié)論.PCR產(chǎn)物的分析,可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法.
凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳,EB溴乙錠染色紫外儀下觀察,初步判斷產(chǎn)物的特異性.PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的一致,特別是多重PCR,應(yīng)用多對引物,其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小,這是起碼條件.
瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用1～2%的瓊脂糖凝膠,供檢測用.
聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好,條帶比較集中,可用于科研及檢測分析.
酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點,用相應(yīng)的酶切、電泳分離后,獲得符合理論的片段,此法既能進行產(chǎn)物的鑒定,又能對靶基因分型,還能進行變異性研究.
分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù),也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法.
Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標記后做探針,與PCR產(chǎn)物雜交.此法既可作特異性鑒定,又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度,還可知其分子量及條帶形狀,主要用于科研.
斑點雜交： 將PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上,再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交,觀察有無著色斑點,主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析.
核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可