DNA鏈中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯鍵連接,合成DNA所用的底物是 2’-脫氧核苷三磷酸.2’,3’ddNTP與普通dNTP不同,它們?cè)诿撗鹾颂堑?’位置缺少一個(gè)羥基.在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的DNA鏈中,但由于沒有3’羥基,不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵,因此,正在延伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸.在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP,鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競(jìng)爭(zhēng),產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈,其長(zhǎng)度取決于引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止位置間的距離.在4組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP,結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸,它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置