1、DNA的分子大小及構(gòu)型
不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗﹥r(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular,cccDNA）>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA.線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢.當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí),環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進(jìn)入膠中,相對(duì)遷移率為0（Rm=0）,而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進(jìn)（Rm>0）,由此可見,這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度.
2、瓊脂糖濃度
一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同.DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系.凝膠濃度的選擇取決于 DNA分子的大小.分離小于0.5kb的DNA段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%.
3、DNA分子的構(gòu)象
當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān).相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)最快,而線狀雙鏈DNA移動(dòng)最慢.如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA.
4、電源電壓
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實(shí)驗(yàn)條件的研究結(jié)果表明,在低濃度、低電壓下,分離效果較好.在低電壓條件下,線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比.但是,在電場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí),不同分子量的DNA段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小.要使大于2kb的DNA段的分辨率達(dá)到最大電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于5V/cm.
5、嵌入染料的存在
熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％.
6、離子強(qiáng)度影響
電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率.在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性.對(duì)于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲(chǔ)于室溫.