龍膽紫或醋酸洋紅

還有堿性染料或改良苯酚品紅溶液


DNA染色實(shí)驗(yàn)
1、原理與解析
(1)真核細(xì)胞的DNA主要分布在細(xì)胞核內(nèi),RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)中.
(2)甲基綠和吡羅紅兩種染色劑對(duì)DNA和RNA的親和力不同,甲基綠對(duì)DNA親和力強(qiáng),使DNA顯現(xiàn)出綠色,而吡羅紅對(duì)RNA的親和力強(qiáng),使RNA呈現(xiàn)出紅色.用甲基綠、吡羅紅的混合染色劑將細(xì)胞染色,可同時(shí)顯示DNA和RNA在細(xì)胞中的分布.(同時(shí)甲基綠用二苯胺或龍膽紫代替做平行)
(3)鹽酸的作用
① 鹽酸能改變細(xì)胞膜的通透性,加速染色劑的跨膜運(yùn)輸；
② 鹽酸使染色體中的DNA與蛋白質(zhì)分離,便于DNA與染色劑的結(jié)合.
注意事項(xiàng)
1.材料的選擇
① 選用的實(shí)驗(yàn)材料既要容易獲得,又要便于觀察；
② 常用的觀察材料由人的口腔上皮細(xì)胞、洋蔥鱗片葉表皮細(xì)胞(為避免原有顏色的干擾,不可使用紫色表皮細(xì)胞)
2.取材要點(diǎn)
① 取口腔上皮細(xì)胞之前,應(yīng)先漱口,以避免裝片中出現(xiàn)太多的雜質(zhì)；
② 取洋蔥表皮細(xì)胞時(shí),盡量避免材料上帶有葉肉組織細(xì)胞.
3.沖洗載玻片時(shí)水的流速要盡量慢,切忌直接用水龍頭沖洗.
4.安全要點(diǎn)
① 用酒精燈烘烤載玻片時(shí),不要只集中于材料處,而應(yīng)將載玻片在火焰上來(lái)回移動(dòng),使載玻片均勻受熱,以免破裂；
② 烘烤后的載玻片不要馬上放入盛有稀鹽酸的燒杯中,最好先自然冷卻1分鐘.
5.換用高倍鏡觀察材料時(shí),只能用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋進(jìn)行調(diào)焦,切不可動(dòng)粗準(zhǔn)焦螺旋.
主要步驟(以觀察口腔上皮細(xì)胞為例)
1.取材
① 滴： 在潔凈的載玻片上滴一滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液；
② 刮： 用消毒牙簽在口腔內(nèi)側(cè)壁上輕輕地刮幾下；
③ 涂： 將牙簽上的碎屑涂抹在載玻片的生理鹽水中；
④ 烘： 將涂有口腔上皮細(xì)胞的載玻片在酒精燈的火焰上烘干.
2.水解
①將烘干的載玻片放入裝有30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的鹽酸的小燒杯中,進(jìn)行材料的水解；
② 保： 將小燒杯放入裝有30℃溫水的大燒杯中保溫5分鐘.
3.沖洗涂片
① 沖： 用緩緩的蒸餾水沖洗載玻片10秒鐘；
② 吸： 用吸水紙吸去載玻片上的水分.
4.染色
① 染：用2滴吡羅紅甲基綠混合染色劑滴在載玻片上,染色5分鐘；
② 吸： 吸去多余染色劑；
③ 蓋： 蓋上蓋玻片.
5.觀察
① 低： 在低倍物鏡下,尋找染色均勻,色澤淺的區(qū)域,移至視野中央,將物像調(diào)節(jié)清晰；
② 高： 轉(zhuǎn)到高倍物鏡,調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋,觀察細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的染色情況.
2%甲基綠水溶液的配制
甲基綠（methyl green） 蒸餾水加至 50mlc 用三氯甲烷抽提, 甲基綠水溶液的抽提：甲基綠為綠色粉末,屬三苯甲烷染料,這種染料是由氯代甲烷作用于結(jié)果晶紫而形成的一 種化合物.由于甲基化作用,甲基綠就比甲基綠后,所引進(jìn)的甲基連接得并不牢固,容易從甲基綠中脫失.另一方面, 在甲基化過(guò)程中,還有一部分結(jié)晶紫并沒有生成甲基綠,因此,也有人認(rèn)為甲中,常有少量的甲基紫或結(jié)晶紫成份.但是,也有人認(rèn)為甲基紫乃是甲基綠的衰敗產(chǎn)物,甲基綠在儲(chǔ)存過(guò)程中,會(huì)不斷產(chǎn)生甲基紫.因此,在配制試劑時(shí),必須 先將甲基綠所含的甲基紫或結(jié)晶紫抽提出來(lái),才能使細(xì)胞核內(nèi)的脫氧核糖核酸染成綠色.抽提方法是取 2%甲基綠水溶 液 20ml 傾入潔凈分液漏斗,加入三氯甲烷 20ml 充分搖蕩混合,使其內(nèi)的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫紅色.旋動(dòng)分液 漏斗下部的砂塞,慢慢把如此反復(fù)更換三氯甲烷,直到三氯甲烷無(wú)紫紅色為止,即可得到得純的甲基綠溶液.
英文名稱：Methyl Green 分子式：C27H35Cl4N3Zn 分子量：608.78 IUPAC 名稱： 4-((4-(dimethylamino)phenyl)(4-(dimethyliminio)cyclohexa-2,5-dieny lidene)methyl)-N-ethyl-N,N-dimethylbenzenaminium dichloride compound with zinc(II) chloride 甲基綠是具有金屬光澤的綠色微結(jié)晶或亮綠色粉末.溶于水,顯藍(lán)綠色. 稍溶于乙醇,不溶于戊醇. 鹽酸中顯紅黃色,在氫氧化鈉中無(wú)色.試劑溶液在可見光區(qū)有吸收峰 (λmax=633.8nm). 與 ReO4-、HgCl42-、BiI4-、AuCl4-和 GaCl4-等形成離子締合物. 用于光度法測(cè)定 Hg2+、ReO4-等,定性檢出鐵氰化物,酸堿指示劑和細(xì) 胞染色劑.
甲基綠為堿性染料,它易與聚合程度高的 DNA 結(jié)合呈現(xiàn)綠色. 又稱雙綠 SF 雙綠 SF.綠色晶體,具金黃色光澤,或淡綠色粉末.溶于水,呈藍(lán) 綠色.微溶于乙醇,不溶于乙醚. 由氯甲烷與甲基紫(C.I.堿性紫 1)反應(yīng)制得. 商品通常為鋅復(fù)鹽 C26H33N3Cl2ZnCl2(稱 C.I.堿性藍(lán) 20). 用于細(xì)菌染色(新鮮標(biāo)本細(xì)胞核染色)甲基綠-鹽酸混合物用于檢定精子、 淋球菌和肥大細(xì)胞染色. 甲基綠可用于鑒定 DNA.DNA 遇甲基綠（常溫）會(huì)被染成藍(lán)綠色. 甲基綠—派洛寧 （methyl green-pyronin）為堿性染料,它分別能與細(xì)胞內(nèi)的 DNA、RNA 結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色.當(dāng)甲基綠與派洛寧作為混合染料時(shí),甲基綠與染色質(zhì)中 DNA 選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色；派洛寧與核仁、細(xì)胞質(zhì)中的 RNA 選擇性結(jié) 合顯示紅色.其原因可能是兩種染料的混合染液中有競(jìng)爭(zhēng)作用,同時(shí)兩種核 酸分子都是多聚體,而其聚合程度有所不同.
甲基綠易與聚合程度高的 DNA 結(jié)合呈現(xiàn)綠色.而派洛寧則與聚合程度較低的 RNA 結(jié)合呈現(xiàn)紅色（但解聚的 DNA 也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn)紅色）.即 RNA 對(duì)派洛寧親和力大,被染成紅色, 而 DNA 對(duì)甲基綠親和力大,被染成綠色.
使用配制方法 關(guān)于吡羅紅和甲基綠分裝粉的使用方法 試劑及配制方法（ 1） 試劑 ） 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.9%的 NaCl 溶液,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 8%的鹽酸,乙酸鈉,乙酸, 蒸餾水,吡羅紅甲基綠混裝粉.如果化學(xué)試劑商店沒有吡羅紅甲基綠混裝粉, 可以分別購(gòu)買甲基綠和吡羅紅 G,然后按 A 液的第二種方法配制（見下文）.（ 2） 染色劑的配制 ） ①染色劑 A 液的兩種配制方法 第一種方法：取吡羅紅甲基綠粉 1 g,加入到 100 mL 蒸餾水中溶解,然 后用濾紙過(guò)濾,將濾液放入棕色瓶中備用. 第二種方法：取甲基綠 2 g 溶于 98 mL 蒸餾水中,取吡羅紅 G 5 g 溶于 95 mL 蒸餾水中.取 6 mL 甲基綠溶液和 2 mL 吡羅紅溶液加入到 16 mL 蒸餾 水中,即為 A 液,放入棕色瓶中備用.（注意：用于核酸染色的是吡羅紅 G, 請(qǐng)不要錯(cuò)買吡羅紅 B.） ②染色劑 B 液的配制方法 B 液是一種緩沖液, 由乙酸鈉和乙酸混合而成. 先取乙酸鈉 16.4 g,用蒸餾水溶解至 1 000 mL 備用；再取乙酸 12 mL,用蒸 餾水稀釋至 1 000 mL 備用.取配好的乙酸鈉溶液 30 mL 和稀釋的乙酸 20 mL, 加蒸餾水 50 mL,配成 pH 為 4.8 的 B 液（緩沖液）. ③染色劑的配制 染色劑是由 A 液、B 液混合配制而成的.取 A 液 20 mL 和 B 液 80 mL 混合,就是實(shí)驗(yàn)中所用的吡羅紅甲基綠染色劑.應(yīng)該注意的是 該試劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用