你說(shuō)的應(yīng)該是real time PCR吧,注意RT其實(shí)是逆轉(zhuǎn)錄reverse transcription的縮寫,和real time一定要分開來(lái).
常說(shuō)的qPCR,qRT-PCR,都是通過(guò)實(shí)時(shí)（real time）的方法,測(cè)定樣品中某個(gè)模版的起始量ct值
但是呢,由于之前RNA提取、反轉(zhuǎn)等步驟,各個(gè)步驟存在不同的效率,ct值并無(wú)法真實(shí)反應(yīng)樣品中模版的絕對(duì)量,因此,需要一個(gè)內(nèi)參來(lái)做為參考.
比方說(shuō),A基因的ct值,在a樣品中是18,在b樣品中是20,由于a b樣品存在RNA質(zhì)量等等一系列不同,你無(wú)法直接就判斷這個(gè)基因在a樣品中的表達(dá)量是b樣品的4倍.
這時(shí)候,我們需要一個(gè)內(nèi)參,假如內(nèi)參ct值在a樣品中是14,而在b樣品中是15.由于內(nèi)參的穩(wěn)定性,在不同樣品中被認(rèn)為是表達(dá)量一致的,因此,A基因的在ab樣品之間的-ΔΔct值是1,也就是表達(dá)量為2倍的關(guān)系.
這里,我們可以知道內(nèi)參的作用,即通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)參,可以在后面分析過(guò)程中將不同樣品的起始量均一化.內(nèi)參需要選擇在不同樣品中有穩(wěn)定表達(dá)量的基因,這就是為什么內(nèi)參經(jīng)常選擇看家基因的原因.以小鼠為例,常用的內(nèi)參有actin gapdh hprt等等.
當(dāng)然,現(xiàn)在的很多觀點(diǎn)認(rèn)為這些基因在不同組織中豐度也不同,例如gapdh,在線粒體含量高的組織中豐度高,很多人認(rèn)為用基因組DNA做內(nèi)參會(huì)更加靠譜,當(dāng)然這是后話了,選擇gapdh無(wú)礙于現(xiàn)階段的實(shí)驗(yàn),如果覺得不靠譜,可以選擇兩個(gè)內(nèi)參.
你所研究的物種,應(yīng)該有人已經(jīng)發(fā)表過(guò)相應(yīng)的內(nèi)參,直接上數(shù)據(jù)庫(kù)搜就可以了.
原創(chuàng)內(nèi)容,碼字不易,萬(wàn)望采納.