氨基酸的紙層析 一、 實驗?zāi)康?1.了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法.2.學(xué)習(xí)紙層析法的操作技術(shù),分析未知樣品氨基酸的成分.二、 實驗原理 用濾紙為支持物進(jìn)行層析的方法,稱為紙層析法,它是分配層析法的一種.紙層析所用的展層溶劑大多是由水飽和的有機(jī)溶劑組成.濾紙纖維的—OH 基的親水性基團(tuán),可吸附有機(jī)溶劑中的水作為固定相,有機(jī)溶劑作為流動相,它沿濾紙自下向上移動,稱為上行層析；反之,使有機(jī)溶劑自上而下移動,稱為下行層析.將樣品點在濾紙上進(jìn)行展層,樣品中的各種氨基酸即在二相中不斷進(jìn)行分配,由于它們各自的分配系數(shù)不同,故在流動相中移動速率不等,從而使不同的氨基酸得到分離和提純.紙層析法主要是依據(jù)混合組分對二相分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離,但亦存在著某種程度的吸附作用和離子交換現(xiàn)象.氨基酸經(jīng)層析在濾紙上形成距原點不等的層析點,氨基酸在濾紙上的移動速率用Rf 表示.Rf = 原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離 只要實驗條件(如溫度、展層溶劑的組分、pH、濾紙的質(zhì)量等)不變,Rf 值是常數(shù),因此可做定性分析參考.如果溶質(zhì)中氨基酸組分較多或其中某些組分的Rf 值相同或近似,用單向?qū)游霾灰藢⑺鼈兎珠_,為此可進(jìn)行雙向?qū)游?在第一溶劑展開后將濾紙轉(zhuǎn)動90度,以第一次展層所得的層析點為原點,再用另一種溶劑展層,即可達(dá)到分離目的.由于氨基酸無色,可利用茚三酮反應(yīng)使氨基酸層析點顯色,從而定性和定量.三、儀器和試劑 儀器 層析濾紙、燒杯、剪刀、層析缸、培養(yǎng)皿、猴頭噴霧器、微量加樣器或毛細(xì)管、吹風(fēng)機(jī)一個、直 尺、鉛筆等.試劑 1.混合氨基酸溶液(水解后的氨基酸干粉) 甘氨酸溶液：50mg 甘氨酸溶于5mL 水中.蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶于5mL 水中.亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶于5mL 水中.氨基酸混合液：甘氨酸50mg,亮氨酸25mg,蛋氨酸25mg 共溶于5mL 水中.2.展層溶劑 堿相溶劑：正丁醇∶12%氨水∶95%乙醇 = 13∶13∶13(V/V) 酸相溶劑：正丁醇∶80%甲酸∶水 = 15∶3∶2(V/V),搖勻后放置半天以上,取上清液備用.3.顯色貯備液：0.4mol/L 茚三酮—異丙醇∶甲酸∶水=20∶1∶5.4.0.1%硫酸銅：75%乙醇=2∶38,臨用前按比例混合.四、實驗步驟 (1)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸單向上行層析法 1.畫基線 戴上指套或橡皮手套,在長約20cm、寬約17cm 濾紙上,距短邊2.5cm 處,用鉛筆畫一條線,即為基線.2.點樣 在原線上,從距紙的長邊4cm處開始,每隔3cm 用微量注射器或毛細(xì)管依次分別點上甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和混合氨基酸溶液.點樣點干后可重復(fù)點加1～2次.每一點的直徑不超過2mm,點樣量以每種氨基酸含5～20ug 為宜.3.展層 將點好樣的濾紙卷成筒形,濾紙兩邊不相接觸,用線固定好,將原線的下端浸入盛有溶劑的培養(yǎng)皿中,不需平衡可立即展層.展層劑為酸性溶劑系統(tǒng),在展層溶劑中加入顯色貯備液(每10mL 展層劑加0.0.5mL 的顯色貯備液)進(jìn)行展層,基線必須保持在液面之上,以免氨基酸與溶劑直接接觸.蓋好層析缸,當(dāng)溶劑前沿距紙端2cm 時(大約3h),取出濾紙.4.顯色 濾紙取出后,吹干或在80℃左右烘箱內(nèi)烘3～5min,即出現(xiàn)紫紅色的氨基酸層析 斑點.用鉛筆劃下層析斑點,可進(jìn)行定性、定量測定.(2)混合氨基酸雙向上行紙層析法 1.濾紙準(zhǔn)備 將濾紙裁成約28cm2的正方形,在距濾紙相鄰兩邊各2cm 處的交點上,用鉛筆劃下一點,做為原點.2.點樣 取混合氨基酸溶液(5mg/mL)10～15μL,分別點在原點上.3.展層與顯色 將點好樣的濾紙卷成半筒形,立在培養(yǎng)皿中,原點應(yīng)在下端.取少量12%的氨水與小燒杯中,蓋好層析缸,平衡過夜.次日,取出氨水,加適量堿相溶劑(第一向)與培養(yǎng)皿中,蓋好層析缸,上行展層,當(dāng)溶劑前沿距濾紙上端1～2cm 時,取出濾紙,冷風(fēng)吹干.將濾紙轉(zhuǎn)90o,再卷成半筒形,豎立在干凈培養(yǎng)皿中,并于小燒杯中至少量酸相溶劑,蓋好層析缸,平衡過夜,次日將加顯色劑的酸性溶劑(每10mL 展層劑加0.0.5mL 的顯色貯備液)傾入培養(yǎng)皿中,進(jìn)行第2向展層.展層畢,取出濾紙,用熱風(fēng)吹干,藍(lán)紫色斑點即顯現(xiàn).五、計算 單向?qū)游龅腞f 值,按 “Rf = 原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離”計量后計算.雙向?qū)游鯮f 值,由兩個數(shù)值組成,在第一向計量一次,第二向計量一次,分別與已知的氨基酸在酸堿系統(tǒng)的Rf 值對比,即可初步?jīng)Q定它為何種氨基酸的斑點,將它剪下,在同一張紙剪下一塊大小相同的空白紙作為對照,用硫酸銅—乙醇溶液洗脫,用722型分光光度計測定其吸光度,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出氨基酸的含量.