土壤DNA?土壤有DNA?土壤微生物?一樣的,用土壤浸出液,照一樣的流程
一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-9bp,可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞,隨后用酚抽提而實現(xiàn)的.這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析,還可用于PCR的模板、文庫構(gòu)建等實驗.2 I+ P7 Y!x d/ {3 {
根據(jù)材料來源不同,采取不同的材料處理方法,而后的DNA提取方法大體類似,但都應(yīng)考慮以下兩個原則：
1、 防止和抑制DNase對DNA的降解.
2、 盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞.
試劑準(zhǔn)備：
1、 TE:10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0).
2、 TBS:25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl." `4 {1 T( G" f+ D9 @0 9 g) e7 y; O
3、 裂解緩沖液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml.& Z1 H,h:o( P7 D
4、 20% SDS 6 k8 i) @+ N5 W- V$ v; y# }2 x
5、 2mg/ml蛋白酶K 2 S9 f$ `) m/ ^4 C
6、 Tris飽和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7、 無水乙醇、75%乙醇
試驗步驟：!y) e% f( A; r; j+ j
材料處理：
1、 新鮮或冰凍組織處理：/ $ \+ @) v2 h; a6 G% \ w' K
1) 取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎,加TE 0.5ml,轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿..R% A.y5 z- N
2) 將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中." F; k$ S4 J9 _' q+ Y2
3) 加20% SDS 25 ml,蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml,混勻.& ^% [8 p!u,H/ x U# `% V( I
4) 60°C水浴1-3hr.
2、 培養(yǎng)細(xì)胞處理：
1) 將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后,用TBS洗滌一次.0 s* r) c:v1 E
2) 離心4000g×5min,去除上清液.# p3 J.U,l.b7 v!_
3) 加10倍體積的裂解緩沖液.2 W4 L% h/ G4 P2 m6 K
4) 50-55°C水浴1-2hr.
DNA提?。?br/>1、 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中,溫和、充分混勻3min.3 ^( k# l,z.E!f5 n% H.a
2、 離心5000g×10min,取上層水相到另一1.5ml離心管中.; _4 u w2 t9 K) f; C) ]!a
3、 加等體積飽和酚,混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中.
4、 加等體積酚/氯仿,輕輕混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中.如水相仍不澄清,可重復(fù)此步驟數(shù)次.# u- t0 }.d5 J" z5 y# o
5、 加等體積氯仿,輕輕混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中.% q/ 3 f,U8 t9 b
6、 加1/10體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）和2.5倍體積的無水乙醇,輕輕倒置混勻.
7、 待絮狀物出現(xiàn)后,離心5000g×5min,棄上清液.
8、 沉淀用75%乙醇洗滌,離心5000g×3min ,棄上清液.
9、 室溫下?lián)]發(fā)乙醇,待沉淀將近透明后加50-100ml TE溶解過夜