【求助】Real-time PCR 引物設(shè)計(jì)求助
【求助】Real-time PCR 引物設(shè)計(jì)求助
通常real-time PCR的引物要分別在兩個(gè)外顯子上,但我要研究的target gene 只有一個(gè)內(nèi)含子,而且如果非要PCR產(chǎn)物跨過內(nèi)含子的話所得出引物特別不好,不是有嚴(yán)重的錯(cuò)配就是有dimer or cross dimer,得到的最好的一對(duì)primer如下：sense:5'GTCTTTCGGATTTCGC Tm 47.9 ,GC 50 ,length 16 ,none(hairpin,dimer,false priming,cross dimer )anti-sense:5'TCGAGGATTTCAACACTGT Tm 47.2 ,GC 42.1 ,length19,found dimer(自由能-7.3) none othersproducts size：209我覺得這對(duì)引物的Tm值過低,產(chǎn)物又過長(zhǎng),請(qǐng)問各位前輩,這對(duì)引物能用于定量PCR中嗎?如果我們?cè)O(shè)計(jì)的引物在一個(gè)外顯子上對(duì)定量的影響有多大?有什么辦法可以減小引物在一個(gè)外顯子上對(duì)定量的影響?
通常real-time PCR的引物要分別在兩個(gè)外顯子上,但我要研究的target gene 只有一個(gè)內(nèi)含子,而且如果非要PCR產(chǎn)物跨過內(nèi)含子的話所得出引物特別不好,不是有嚴(yán)重的錯(cuò)配就是有dimer or cross dimer,得到的最好的一對(duì)primer如下：sense:5'GTCTTTCGGATTTCGC Tm 47.9 ,GC 50 ,length 16 ,none(hairpin,dimer,false priming,cross dimer )anti-sense:5'TCGAGGATTTCAACACTGT Tm 47.2 ,GC 42.1 ,length19,found dimer(自由能-7.3) none othersproducts size：209我覺得這對(duì)引物的Tm值過低,產(chǎn)物又過長(zhǎng),請(qǐng)問各位前輩,這對(duì)引物能用于定量PCR中嗎?如果我們?cè)O(shè)計(jì)的引物在一個(gè)外顯子上對(duì)定量的影響有多大?有什么辦法可以減小引物在一個(gè)外顯子上對(duì)定量的影響?
生物人氣：723 ℃時(shí)間：2020-07-04 06:06:04
優(yōu)質(zhì)解答
博凌科為-為你1.跨越內(nèi)含子主要為了避免抽提、反轉(zhuǎn)錄過程中殘留基因組DNA污染的干擾,因?yàn)榛蚪MDNA是不會(huì)存在兩個(gè)外顯子連續(xù)這樣一段序列的,如果引物只在一個(gè)外顯子上就要冒這種風(fēng)險(xiǎn)2.個(gè)人感覺引物能不能工作,上下游引物的Tm值要接近,這個(gè)最重要,至于別的發(fā)卡,莖環(huán)等就要看運(yùn)氣了,不行的話就再試幾個(gè),實(shí)在不行就用老外文獻(xiàn)上的引物好了,記得注明參考文獻(xiàn)就行了.good luck
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