目的
　　了解密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞的原理及其操作過程.
　　原理
　　淋巴細(xì)胞分離掖是由60%的聚蔗糖2份和34%的泛影葡胺1份混合制成.它具有分子量大、無化學(xué)活性、20℃時(shí)比重為1.077士0.001的特性.血液中各種細(xì)胞的比重不同,淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞的比重約為1.070,而粒細(xì)胞和紅細(xì)胞的比重為1.092左右.將血液加至分離液上,通過離心,可使一定比重的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度進(jìn)行分布,從而將淋巴細(xì)胞與其它血細(xì)胞分離開.
　　材料
　　1.淋巴細(xì)胞分離液 (比重1.077土0.001).
　　2.肝素.
　　3.無Ca2+、Mg2+的Hanks溶液,pH7.7.6.
　　4.RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清).
　　5.其它:注射器、吸管、滴管（均為無菌）,血球計(jì)數(shù)板,水平離心機(jī),顯微鏡等.
　　方法
　　1.無菌抽取靜脈血2ml,去掉針頭注人含有肝素的無菌試管中搖勻,加入2ml Hanks溶液進(jìn)行對(duì)倍稀釋,混勻.
　　2.用吸管吸取稀釋血液沿試管壁緩緩加到含有2ml淋巴細(xì)胞分離液的試管中（血液:Hanks液:淋巴細(xì)胞分離液的比例為1:1:1）,沿管壁流下的稀釋血液疊加在分離液之上,并與分離液形成明顯的界面.
　　3.經(jīng)水平式離心2000r/min×20min,小心取出試管.
　　4.用平口吸管小心吸取中層呈白色霧狀的淋巴細(xì)胞層,用Hanks溶液洗滌兩次,每次離心1500r/min×10min.
　　5.棄上清,加RPMI-1640培養(yǎng)液1ml混勻,取少許進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定.
　?。?） 細(xì)胞計(jì)數(shù):取1滴細(xì)胞懸液置血球計(jì)數(shù)板上,靜置片刻,顯微鏡下計(jì)數(shù)四角四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)（見圖15）,按下列公式計(jì)算出細(xì)胞總數(shù).
　　四個(gè)大方格細(xì)胞總數(shù) ×稀釋倍數(shù)×細(xì)胞懸液毫升數(shù)×104
　　細(xì)胞總數(shù) = 4
　?。?）臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞活力:取4份0.2%臺(tái)盼藍(lán)與1份4.25%生理鹽水混合,將臺(tái)盼藍(lán)生理鹽水溶液與細(xì)胞懸液等量混合,在3分鐘之內(nèi)壓片,在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)未染色的細(xì)胞（為活細(xì)胞）與染色細(xì)胞（染成蘭色,為死細(xì)胞）,計(jì)算活細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù).
　　活細(xì)胞數(shù) ×100%.
　　細(xì)胞存活率＝ 活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)
　　6.最后將淋巴細(xì)胞懸液用RPMI-1640培養(yǎng)液配成相應(yīng)的細(xì)胞濃度備用.
　　結(jié)果
　　在回收細(xì)胞分離液上界面的總細(xì)胞中單個(gè)核細(xì)胞應(yīng)占90%以上（同時(shí)細(xì)胞存活率應(yīng)大于90%）,其中的粒細(xì)胞占0-5%,血小板小于0.5%,紅細(xì)胞占0-7%.
　　注意事項(xiàng)
　　1.抽血后在2小時(shí)內(nèi)使用.
　　2.注意將稀釋后的血輕輕地沿管壁鋪在聚蔗糖液面上,避免破壞其界面.
　　3.在收集單個(gè)核細(xì)胞時(shí),將吸管輕輕插入單個(gè)核細(xì)胞層,沿管壁輕輕旋轉(zhuǎn)吸取細(xì)胞.
　　整個(gè)試驗(yàn)給你 有詳細(xì)步驟的
　　希望我的回答對(duì)你有所幫助