1.根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化
蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì),并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同,因此可以利用一些較簡(jiǎn)單的方法使蛋白
質(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi),并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離.根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過(guò)濾等.透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時(shí)常用的方法.透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液進(jìn)行分離.超濾是利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過(guò)半透膜,而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過(guò)程.這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無(wú)機(jī)鹽為主的小分子分開(kāi).它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用,在進(jìn)行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無(wú)機(jī)鹽.由于超濾過(guò)程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質(zhì)的分子量也越來(lái)越小.所以在使用超濾方法時(shí)要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過(guò)濾得到更理想的效果
離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時(shí)可以利用離心的方法將它們分開(kāi).例如,在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中,加入纖維素酶和α-淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理后,再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進(jìn)行初步分離[3].使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度(區(qū)帶)離心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根據(jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度.密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低.蔣辰等[6]通過(guò)比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白.凝膠過(guò)濾也稱凝膠滲透層析,是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一.凝膠過(guò)濾的原理是當(dāng)不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí),比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運(yùn)動(dòng)并最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外.目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等.在甘露糖蛋白提純的過(guò)程中使用凝膠過(guò)濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(zhì)(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1].凝膠過(guò)濾在抗凝血蛋白的提取過(guò)程中也被用來(lái)除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)[7].
2.根據(jù)溶解度不同進(jìn)行分離純化
影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等.但在同一條件下,不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度,根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件,就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度,達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的.常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等.
等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法.每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點(diǎn),而且在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最
低;相反,有些蛋白質(zhì)在一定pH值時(shí)很容易溶解.因而可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值來(lái)分離純化蛋白質(zhì).王洪新等[8]研究茶葉蛋白質(zhì)提取過(guò)程發(fā)現(xiàn),pH值為時(shí)茶葉蛋白提取效果最好,提取率達(dá)到36·8%,初步純化得率為91·0%.李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時(shí)將蛋白溶液的pH值調(diào)到3~4,使目標(biāo)蛋白于等電點(diǎn)沉淀出來(lái).等電點(diǎn)沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取.李鳳英等[10]測(cè)得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為3·8.他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì),得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達(dá)73·78%.另外還可以利用堿法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取[11].利用酸法提取得到的鰱魚(yú)魚(yú)肉蛋白質(zhì)無(wú)腥味、色澤潔白,蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達(dá)90%[12].
蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象,其中,增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶,反之為鹽析.應(yīng)當(dāng)指出,同樣濃度的二價(jià)離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對(duì)蛋白質(zhì)溶解度影響的效果,要比一價(jià)離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來(lái)提取蛋白質(zhì),其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質(zhì)提取率為57·25%[10].鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn).由于硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對(duì)蛋白質(zhì)的破壞,應(yīng)用氨水調(diào)pH值至中性.為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象,蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用鹽溶和鹽析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提純后,通常要使用透析或者凝膠過(guò)濾的方法除去中性鹽[13].
有機(jī)溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下,引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同,因此,控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì).例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14].由于在室溫下,有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀,而且伴隨著變性.因此,通常要將有機(jī)溶劑冷卻,然后在不斷攪拌下加入有機(jī)溶劑防止局部濃度過(guò)高,蛋白質(zhì)變性問(wèn)題就可以很大程度上得到解決.對(duì)于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中極性側(cè)鏈較多、不溶于水的蛋白質(zhì),可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑提取,它們有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性,是理想的提取液.冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制備丙種球蛋白.冷乙醇法也是目前WHO規(guī)程和中國(guó)生物制品規(guī)程推薦的方法,不僅分辨率高、提純效果好、可同時(shí)分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15].
萃取是分離和提純有機(jī)化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團(tuán)萃取可以用來(lái)分離蛋白質(zhì).雙水相萃取技術(shù)(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由于被分離物在兩相中分配的不同,便可實(shí)現(xiàn)分離,被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取.此方法可以在室溫環(huán)境下進(jìn)行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,收率較高.對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì),需要先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有效破碎.目的蛋白常分布在上相并得到濃縮,細(xì)胞碎片等固體物分布在下相中.采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強(qiáng)度、鹽類型及濃度的影響[16].
反膠團(tuán)萃取法是利用反膠團(tuán)將蛋白質(zhì)包裹其中而達(dá)到提取蛋白質(zhì)的目的.反膠團(tuán)是當(dāng)表面活性劑
在非極性有機(jī)溶劑溶解時(shí)自發(fā)聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體.這種方法的優(yōu)點(diǎn)是萃取過(guò)程中蛋
白質(zhì)因位于反膠團(tuán)的內(nèi)部而受到反膠團(tuán)的保護(hù).程世賢等[17]就利用反膠團(tuán)萃取法提取了大豆中的蛋白質(zhì).
3.根據(jù)電荷不同進(jìn)行分離純化
根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層析兩類.
在外電場(chǎng)的作用下,帶電顆粒(如不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子)將向著與其電性相反的電極移動(dòng),這
種現(xiàn)象稱為電泳.聚丙烯酰胺電泳是一種以聚丙烯酰胺為介質(zhì)的區(qū)帶電泳,常用于分離蛋白質(zhì).它的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、樣品用量少.等電聚焦是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù),也可以用于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定.利用等電聚焦技術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的.在外電場(chǎng)作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦在等于其等電點(diǎn)的pH值梯度處形成一個(gè)窄條帶.孫臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質(zhì)中的應(yīng)用.結(jié)果發(fā)現(xiàn),聚丙烯酰胺電泳的條帶分辨率低,加樣量不高;等電聚焦電泳分辨率最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區(qū)帶分辨率較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大.
離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法.離子交換層析中,基質(zhì)由帶有電荷的樹(shù)脂或纖維素組成.帶有正電荷的為陰離子交換樹(shù)脂;反之為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂.離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同.陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì),被留在層析柱上,通過(guò)提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái),其中結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來(lái).反之陽(yáng)離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì),結(jié)合的蛋白可以通過(guò)逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來(lái).李全宏等[19]將離子交換層析應(yīng)用于濃縮蘋(píng)果汁中蛋白質(zhì)的提純.另外,離子交換層析還用于抗凝血蛋白的提取[7].
4. 利用對(duì)配體的特異親和力進(jìn)行分離純化
親和層析是利用蛋白質(zhì)分子對(duì)其配體分子特有的識(shí)別能力(即生物學(xué)親和力)建立起來(lái)的一種有效的純化方法.它通常只需一步處理即可將目的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來(lái),并且純度相當(dāng)高.應(yīng)用親和層析須了解純化物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性,以便設(shè)計(jì)出最好的分離條件.近年來(lái),親和層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于靶標(biāo)蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因?yàn)槿诤系鞍拙哂刑禺愋越Y(jié)合能力[20].親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應(yīng)用也相當(dāng)廣泛[21].范繼業(yè)等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達(dá)到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達(dá)到62·5%.該方法成本較低,吸附劑價(jià)格低廉、機(jī)械強(qiáng)度高、抗污染能力較強(qiáng)、非特異性吸附較小、可反復(fù)使用、適用性廣,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定.