鑒定了磷酸化肽后,還要進一步確定磷酸化肽中修飾了磷酸化位點的哪個殘基.用于確定磷酸化肽中磷酸化位點的質譜方法基于兩種不同原理,第一種方法取決于磷酸酯鍵的化學穩(wěn)定性,如在ESI質譜儀的碰撞室或離子源中,或在MALDI-MS的PSD過程中.磷酸化肽可通過磷酸酯鍵斷裂產(chǎn)生的碎片離子鑒定.第二種方法基于肽段增加的磷酸酯基團的質量數(shù).假如蛋白是已知的,可通過質量數(shù)來確定肽段.在某些情況下,肽段只含有一個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基,則很輕易找到磷酸化位點,但在大多數(shù)情況下肽段含有很多個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基,則確定磷酸化位點發(fā)生困難.