先給你貼個(gè)東西你先看一下 希望對(duì)你有幫助
將特定的外源基因構(gòu)建在植物表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)入受體植物,并不是植物遺傳轉(zhuǎn)化的最終目的.理想的轉(zhuǎn)基因植物往往需要外源基因在特定部位和特定時(shí)間內(nèi)高水平表達(dá),產(chǎn)生人們期望的表型性狀.然而,近二十年的發(fā)展歷史卻表明,外源基因在受體植物內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)表達(dá)效率低、表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定甚至基因失活或沉默等不良現(xiàn)象,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物無法投入實(shí)際應(yīng)用.另外,轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題已在許多國(guó)家引起人們的關(guān)注,例如,轉(zhuǎn)基因有可能隨花粉擴(kuò)散,抗生素篩選標(biāo)記基因有可能使臨床上的某些抗生素失去作用等等.以上問題的出現(xiàn)使得植物基因工程這一高新技術(shù)正處于一種前所未有的困擾時(shí)期.針對(duì)這些問題,近幾年人們對(duì)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行了多方面的探索和改進(jìn),植物表達(dá)載體的改進(jìn)和優(yōu)化就是其中最重要的一項(xiàng)內(nèi)容,本文就已經(jīng)取得的進(jìn)展進(jìn)行綜述.
1 啟動(dòng)子的選用和改造
外源基因表達(dá)量不足往往是得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物的重要原因.由于啟動(dòng)子在決定基因表達(dá)方面起關(guān)鍵作用,因此,選擇合適的植物啟動(dòng)子和改進(jìn)其活性是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首先要考慮的問題.
目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子,例如,絕大多數(shù)雙子葉轉(zhuǎn)基因植物均使用CaMV35S啟動(dòng)子,單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來自玉米的Ubiquitin啟動(dòng)子和來自水稻的Actinl啟動(dòng)子.在這些組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下,外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會(huì)表達(dá).然而,外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達(dá)不但造成浪費(fèi),往往還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變,影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育.為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用,同時(shí)又可減少對(duì)植物的不利影響,目前人們對(duì)特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來越重視.已發(fā)現(xiàn)的特異性啟動(dòng)子主要包括器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子.例如,種子特異性啟動(dòng)子、果實(shí)特異性啟動(dòng)子、葉肉細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子、損傷誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、化學(xué)誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、熱激誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子等.這些特異性啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ).例如,瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)基因煙草中Bt毒蛋白基因的表達(dá),由于該啟動(dòng)子可受水楊酸及其衍生物誘導(dǎo),通過噴酒廉價(jià)、無公害的化學(xué)物質(zhì),誘導(dǎo)抗蟲基因在蟲害重發(fā)生季節(jié)表達(dá),顯然是一個(gè)十分有效的途徑.
在植物轉(zhuǎn)基因研究中,使用天然的啟動(dòng)子往往不能取得令人滿意的結(jié)果,尤其是在進(jìn)行特異表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí),表達(dá)水平大多不夠理想.對(duì)現(xiàn)有啟動(dòng)子進(jìn)行改造,構(gòu)建復(fù)合式啟動(dòng)子將是十分重要的途徑.例如,Ni等人將章魚堿合成酶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)與甘露堿合成酶基因啟動(dòng)子構(gòu)成了復(fù)合啟動(dòng)子,GUS表達(dá)結(jié)果表示：改造后的啟動(dòng)子活性比35S啟動(dòng)子明顯提高.吳瑞等人將操作誘導(dǎo)型的PI-II基因啟動(dòng)子與水稻Actinl基因內(nèi)含子1進(jìn)行組合,新型啟動(dòng)子的表達(dá)活性提高了近10倍（專利）.在植物基因工程研究中,這些人工組建的啟動(dòng)子發(fā)揮了重要作用.
2 增強(qiáng)翻譯效率
為了增強(qiáng)外源基因的翻譯效率,構(gòu)建載體時(shí)一般要對(duì)基因進(jìn)行修飾,主要考慮三方面內(nèi)容：
2.1添加5‘-3‘-非翻譯序列
許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn),真核基因的5‘-3‘-非翻譯序列（UTR）對(duì)基因的正常表達(dá)是非常必要的,該區(qū)段的缺失常會(huì)導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性和翻譯水平顯著下降.例如,在煙草花葉病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻譯起始位點(diǎn)上游,有一個(gè)由68bp核苷酸組成的Ω元件,這一元件為核糖體提供了新的結(jié)合位點(diǎn),能使Gus基因的翻譯活性提高數(shù)十倍.目前已有許多載體中外源基因的5‘-端添加了Ω翻譯增強(qiáng)序列.Ingelbrecht等曾對(duì)多種基因的 3‘-端序列進(jìn)行過研究,發(fā)現(xiàn)章魚堿合成酶基因的3‘-端序列能使NPTII基因的瞬間表達(dá)提高20倍以上.另外,不同基因的3‘-端序列增進(jìn)基因表達(dá)的效率有所不同,例如,rbcS3‘-端序列對(duì)基因表達(dá)的促進(jìn)作用比查爾酮合酶基因的3‘-端序列高60倍.
2.2 優(yōu)化起始密碼周邊序列
雖然起始密碼子在生物界是通用的,然而,從不同生物來源的基因各有其特殊的起始密碼周邊序列.例如,植物起始密碼子周邊序列的典型特征是AACCAUGC,動(dòng)物起始密碼子周邊序列為CACCAUG,原核生物的則與二者差別較大.Kozak詳細(xì)研究過起始密碼子ATG周邊堿基定點(diǎn)突變后對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成的影響,并總結(jié)出在真核生物中,起始密碼子周邊序列為ACCATGG時(shí)轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高,特別是-3位的A對(duì)翻譯效率非常重要.該序列被后人稱為Kozak序列,并被應(yīng)用于表達(dá)載體的構(gòu)建中.例如,有一個(gè)細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶基因,原來的起始密碼周邊序列為UUUAUGG,當(dāng)被修飾為ACCAUGG,其在煙草中的表達(dá)水平提高了8倍.因此,利用非植物來源的基因構(gòu)建表達(dá)載體時(shí),應(yīng)根據(jù)植物起始密碼子周邊序列的特征加以修飾改造.
2.3對(duì)基因編碼區(qū)加以改造
如果外源基因是來自于原核生物,由于表達(dá)機(jī)制的差異,這些基因在植物體內(nèi)往往表達(dá)水平很低,例如,來自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達(dá)量非常低,研究發(fā)現(xiàn)這是由于原核基因與植物基因的差異造成了mRNA穩(wěn)定性下降.美國(guó)Monsanto公司Perlak等人在不改變毒蛋白氨基酸序列的前提下,對(duì)殺蟲蛋白基因進(jìn)行了改造,選用植物偏愛的密碼子,增加了GC含量,去除原序列下影響mRNA穩(wěn)定的元件,結(jié)果在轉(zhuǎn)基因植株中毒蛋白的表達(dá)量增加了30～100倍,獲得了明顯的抗蟲效果.
3 消除位置效應(yīng)
當(dāng)外源基因被移人受體植物中之后,它在不同的轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平往往有很大差異.這主要是由于外源基因在受體植物的基因組內(nèi)插入位點(diǎn)不同造成的.這就是所謂的"位置效應(yīng)".為了消除位置效應(yīng),使外源基因都能夠整合在植物基因組的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū),在目前的表達(dá)載體構(gòu)建策略中通常會(huì)考慮到核基質(zhì)結(jié)合區(qū)以及定點(diǎn)整合技術(shù)的應(yīng)用.
核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrix association region,MAR）是存在于真核細(xì)胞染色質(zhì)中的一段與核基質(zhì)特異結(jié)合的DNA序列.一般認(rèn)為,MAR序列位于轉(zhuǎn)錄活躍的DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)哉的邊界,其功能是造成一種分割作用,使每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元保持相對(duì)的獨(dú)立性,免受周圍染色質(zhì)的影響.有關(guān)研究表明,將MAR置于目的基因的兩側(cè),構(gòu)建成包含MAR-gene-MAR結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體,用于遺傳轉(zhuǎn)化,能明顯提高目的基因的表達(dá)水平,降低不同轉(zhuǎn)基因植株之間目的基因表達(dá)水平的差異,減少位置效應(yīng).例如,Allen等人研究了異源MAR（來自酵母）和同源MAR（來自煙草）對(duì)Gus基因在煙草中表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)酵母的MAR能使轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平平均提高12倍,而煙草本身的MAR能使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平平均提高60倍.使用來源于雞溶菌酶基因的MAR也可起到同樣作用.
另一可行的途徑是采用定點(diǎn)整合技術(shù),這一技術(shù)的主要原理是,當(dāng)轉(zhuǎn)化載體含有與寄主染色體同源的DNA片段時(shí),外源基因可以通過同源重組定點(diǎn)整合于染色體的特定部位.實(shí)際操作時(shí)首先要分離染色體轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的DNA片段,然后構(gòu)建植物表達(dá)載體.在微生物的遺傳操作中,同源重組定點(diǎn)整合已成為一項(xiàng)常規(guī)技術(shù),在動(dòng)物中外源基因的定點(diǎn)整合已獲得成功,而在植物中除了葉綠體表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合以外,細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中還很少有成功的報(bào)道.
4 構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體
為了克服細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中經(jīng)常出現(xiàn)的外源基因表達(dá)效率低,位置效應(yīng)及由于核基因隨花粉擴(kuò)散而帶來的不安全性等問題,近幾年出現(xiàn)的一種新興的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)--葉綠體轉(zhuǎn)化,正以它的優(yōu)越性和發(fā)展前景日益為人們所認(rèn)識(shí)并受到重視.到目前為止,已在煙草、水稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜（侯丙凱等,等發(fā)表）5種植物中相繼實(shí)現(xiàn)了葉綠體轉(zhuǎn)化,使得這一轉(zhuǎn)化技術(shù)開始成為植物基因工程中新的生長(zhǎng)點(diǎn).
由于目前多種植物的葉綠體基因組全序列已被測(cè)定,這就為外源基因通過同源重組機(jī)制定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組奠定了基礎(chǔ),目前構(gòu)建的葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)整合載體.構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)事例載體.構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體時(shí),一般都在外源基因表達(dá)盒的兩側(cè)各連接一段葉綠體的DNA序列,稱為同源重組片段或定位片段（Targeting fragment）.當(dāng)載體被導(dǎo)入葉綠體后,通過這兩個(gè)片段與葉綠體基因組上的相同片段發(fā)生同源重組,就可能將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn).在以作物改良為目的的葉綠體轉(zhuǎn)化中,要求同源重組發(fā)生以后,外源基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失,又不致于破壞插入點(diǎn)處原有基因的功能.為滿足這一要求,已有的工作都選用了相鄰的兩個(gè)基因作為同源重組片段,例如rbcL/accD,16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB.當(dāng)同源重組發(fā)生以后,外源基因定點(diǎn)插入在兩個(gè)相鄰基因的間隔區(qū),保證了原有基因的功能不受影響.最近,Daniel等利用煙草葉綠體基因trnA和trnI作為同源重組片段,構(gòu)建了一種通用載體（universal vector）.由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的,作者認(rèn)為這種載體可用于多種不同植物的葉綠體轉(zhuǎn)化.如果這種載體的通用性得到證實(shí),那么這項(xiàng)工作無疑為構(gòu)建方便而實(shí)用的新型葉綠體表達(dá)載體提供了一個(gè)好的思路.
由于葉綠體基因組的高拷貝性,定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組的外源基因往往會(huì)得到高效率表達(dá),例如McBride等人首次將Bt CryIA(c)毒素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體,Bt毒素蛋白的表達(dá)量高達(dá)葉子總蛋白的3%～5%,而通常的核轉(zhuǎn)化技術(shù)只能達(dá)到0.001%～0.6%.最近,Kota等將Bt Cry2Aa2蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草轉(zhuǎn)入煙草葉綠體,也發(fā)現(xiàn)毒蛋白在煙草葉子中的表達(dá)量很高,占可溶性蛋白的2%～3%,比細(xì)胞核轉(zhuǎn)化高出20～30倍,轉(zhuǎn)基因煙草不僅能抗敏感昆蟲,而且能夠百分之百地殺死那些產(chǎn)生了高抗性的昆蟲.Staub等最近報(bào)道,將人的生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體,其表達(dá)量竟高達(dá)葉片總蛋白的7%,比細(xì)胞核轉(zhuǎn)化高出300倍.這些實(shí)驗(yàn)充分說明,葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化,是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的重要途徑之一.
5 定位信號(hào)的應(yīng)用
上述幾種載體優(yōu)化策略主要目的是提高外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率,然而,高水平表達(dá)的外源蛋白能否在植物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在以及積累量的多少是植物遺傳轉(zhuǎn)化中需要考慮的另一重要問題.
近幾年的研究發(fā)現(xiàn),如果某些外源基因連接上適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘?hào)序列,使外源蛋白產(chǎn)生后定向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的特定部位,例如：葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡等,則可明顯提高外源蛋白的穩(wěn)定性和累積量.這是因?yàn)閮?nèi)質(zhì)網(wǎng)等特定區(qū)域?yàn)槟承┩庠吹鞍滋峁┝艘粋€(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境,有效防止了外源蛋白的降解.例如,Wong等將擬南芥rbcS亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于殺蟲蛋白基因之前,發(fā)現(xiàn)殺蟲蛋白能夠特異性地積累在轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠體內(nèi),外源蛋白總的積累量比對(duì)照提高了10～20倍.最近,葉梁、宋艷茹等也將rbcS亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于PHB合成相關(guān)基因之前,試圖使基因表達(dá)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因油菜種子的質(zhì)體中積累,從而提高外源蛋白含量.另外,Wandelt等和Schouten等將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列（四肽KDEL的編碼序列）與外源蛋白基因相連接,發(fā)現(xiàn)外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的含量有了顯著提高.顯然,定位信號(hào)對(duì)于促進(jìn)蛋白質(zhì)積累有積極作用,但同一種定位信號(hào)是否適用于所有的蛋白還有待于進(jìn)一步確定.
6 內(nèi)含子在增強(qiáng)基因表達(dá)方面的應(yīng)用
內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的作用最初是由Callis等在轉(zhuǎn)基因玉米中發(fā)現(xiàn)的,玉米乙醇脫氫酶基因（Adhl）的第一個(gè)內(nèi)含子（intron 1）對(duì)外源基因表達(dá)有明顯增強(qiáng)作用,該基因的其他內(nèi)含子（例如intron8,intron9）也有一定的增強(qiáng)作用.后來,Vasil等也發(fā)現(xiàn)玉米的果糖合成酶基因的第一個(gè)內(nèi)含子能使CAT表達(dá)水平提高10倍.水稻肌動(dòng)蛋白基因的第三個(gè)內(nèi)含子也能使報(bào)道基因的表達(dá)水平提高2～6倍.至今對(duì)內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的機(jī)制不不清楚,但一般認(rèn)為可能是內(nèi)含子的存在增強(qiáng)了mRNA的加工效率和mRNA穩(wěn)定性.Tanaka等人的多項(xiàng)研究表明,內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的增強(qiáng)作用主要發(fā)生在單子葉植物,在雙子葉植物中不明顯.
由于內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)有增強(qiáng)作用,Mcelroy等在構(gòu)建單子葉植物表達(dá)載體時(shí),特意將水稻的肌動(dòng)蛋白基因的第一個(gè)內(nèi)含子保留在該基因啟動(dòng)子的下游.同樣,Christensen等在構(gòu)建載體時(shí)將玉米Ubiquitin基因的第一個(gè)內(nèi)含子置于啟動(dòng)子下游,以增強(qiáng)外源基因在單子葉植物中的表達(dá).然而,有研究指出,特定內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的促進(jìn)作用取決于啟動(dòng)子強(qiáng)度、細(xì)胞類型、目的基因序列等多種因素,甚至有時(shí)會(huì)取決于內(nèi)含子在載體上的位置.例如,玉米Adhl基因的內(nèi)含子9置于Gus基因的5‘端,在CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控下,Gus基因的表達(dá)未見增強(qiáng)；當(dāng)把內(nèi)含子置于Gus基因3端,在同樣的啟動(dòng)子控制下,Gus基因的表達(dá)水平卻增加了大約3倍.由此可見,內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的作用機(jī)制可能是很復(fù)雜的,如何利用內(nèi)含子構(gòu)建高效植物表達(dá)載體,目前還缺乏一個(gè)固定的模式,值得進(jìn)一步探討.
7 多基因策略
迄今為止,多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究都是將單一的外源基因轉(zhuǎn)入受體植物.但有時(shí)由于單基因表達(dá)強(qiáng)度不夠或作用機(jī)制單一,尚不能獲得理想的轉(zhuǎn)基因植物.如果把兩個(gè)或兩個(gè)以上的能起協(xié)同作用的基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植物,將會(huì)獲得比單基因轉(zhuǎn)化更為理想的結(jié)果.這一策略在培育抗病、抗蟲等抗逆性轉(zhuǎn)基因植物方面已得到應(yīng)用.例如,根據(jù)抗蟲基因的抗蟲譜及作用機(jī)制的不同,可選擇兩個(gè)功能互補(bǔ)的基因進(jìn)行載體構(gòu)建,并通過一定方式將兩個(gè)抗蟲基因同時(shí)轉(zhuǎn)入一個(gè)植物中去.王偉等將外源凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因同時(shí)轉(zhuǎn)入棉花,得到了含雙價(jià)抗蟲基因的轉(zhuǎn)化植株.Barton等將Bt殺蟲蛋白基因和蝎毒素基因同時(shí)轉(zhuǎn)入煙草,其抗蟲性和防止害蟲產(chǎn)生抗性的能力大為提高（專利）.在抗病方面,本實(shí)驗(yàn)室藍(lán)海燕等構(gòu)建了包含β-1,3-葡聚糖酶基因及幾丁質(zhì)酶基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體,并將其導(dǎo)入油菜和棉花,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株均產(chǎn)生了明顯的抗病性.最近,馮道榮、李寶健等將2～3個(gè)抗真菌病基因和hpt基因連在一個(gè)載體上,兩個(gè)抗蟲基因與bar基因連在另一個(gè)載體上,用基因槍將它們共同導(dǎo)入水稻植株中,結(jié)果表明,70%的R.代植株含有導(dǎo)入的全部外源基因（6～7個(gè)）,且導(dǎo)入的多個(gè)外源基因趨向于整合在基因組的一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn).
一般常規(guī)的轉(zhuǎn)化,尚不能將大于25kb的外源DNA片段導(dǎo)入植物細(xì)胞.而一些功能相關(guān)的基因,比如植物中的數(shù)量性狀基因、抗病基因等,大多成"基因簇"的形式存在.如果將某些大于100kb的大片段DNA,如植物染色體中自然存在的基因簇或并不相連鎖的一系列外源基因?qū)胫参锘蚪M的同一位點(diǎn),那么將有可能出現(xiàn)由多基因控制的優(yōu)良性狀或產(chǎn)生廣譜的抗蟲性、抗病性等,還可以賦予受體細(xì)胞一種全新的代謝途徑,產(chǎn)生新的生物分子.不僅如此,大片段基因群或基因簇的同步插入還可以在一定程度上克服轉(zhuǎn)基因帶來的位置效應(yīng),減少基因沉默等不良現(xiàn)象的發(fā)生.最近,美國(guó)的Hamilton和中國(guó)的劉耀光分別開發(fā)出了新一代載體系統(tǒng),即具有克隆大片段DNA和借助于農(nóng)桿菌介導(dǎo)直接將其轉(zhuǎn)化植物的BIBAC和TAC.這兩種載體不僅可以加速基因的圖位克隆,而且對(duì)于實(shí)現(xiàn)多基因控制的品種改良也會(huì)有潛在的應(yīng)用價(jià)值.目前,關(guān)于BIBAC和TAC載體在多基因轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用研究還剛剛開始.
8 篩選標(biāo)記基因的利用和刪除
篩選標(biāo)記基因是指在遺傳轉(zhuǎn)化中能夠使轉(zhuǎn)化細(xì)胞（或個(gè)體）從眾多的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出來的標(biāo)記基因.它們通常可以使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)某種選擇劑具有抗性的產(chǎn)物,從而使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在添加這種選擇的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),而非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞由于缺乏抗性則表現(xiàn)出對(duì)此選擇劑的敏感性,不能生長(zhǎng)、發(fā)育和分化.在構(gòu)建載體時(shí),篩選標(biāo)記基因連接在目的基因一旁,兩者各有自己的基因調(diào)控序列（如啟動(dòng)子、終止子等）.目前常用的篩選標(biāo)記基因主要有兩大類：抗生素抗性酶基因和除草劑抗性酶基因.前者可產(chǎn)生對(duì)某種抗生素的抗性,后者可產(chǎn)生對(duì)除草劑的抗性.使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因（產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶,抗卡那霉素）、HPT基因（產(chǎn)生潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶,抗潮霉素）和Gent基因（抗慶大霉素）等.常用的抗除草劑基因包括EPSP基因（產(chǎn)生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶,抗草甘磷）、GOX基因（產(chǎn)生草甘膦氧化酶、降解草甘膦）、bar基因（產(chǎn)生PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶,抗Bialaphos或glufosinate）等.
上面這些當(dāng)中1、2、3、5、6都是值得注意的,特別是5,因?yàn)槟阋蚣?xì)胞外分泌.骨架載體可以選擇PB I121,然后你可以在上面改動(dòng)基因型.
后面的就是克隆的步驟了,相對(duì)簡(jiǎn)單.
1 首先獲得目的基因加酶切位點(diǎn),連入改好的載體中.
2 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a擴(kuò)增
3 將擴(kuò)增好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)
4 收集根細(xì)胞外培養(yǎng)基檢測(cè)是否有該蛋白的表達(dá)和分泌.
至于改造載體那幾個(gè)步驟要是答題的話簡(jiǎn)單說說就可以了,畢竟如果真的做出一個(gè)好載體都可以自己開公司了.