染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)指南及技術(shù)總結(jié)
ChIP是一項(xiàng)比較流行的研究轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor,TF）與啟動(dòng)子（promoter）相互結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù).由于ChIP采用甲醛固定活細(xì)胞或者組織的方法,所以能比較真實(shí)的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況.當(dāng)用甲醛處理時(shí),相互靠近的蛋白與蛋白,蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵.細(xì)胞內(nèi),當(dāng)TF與Promoter相互結(jié)合（生物意義上的結(jié)合）時(shí),它們必然靠的比較近,或者契合在一起,這個(gè)時(shí)候用甲醛處理,能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵.
染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChiP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來(lái)的方法,它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物,并通過(guò)超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過(guò)抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè),從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息.它能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白,是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的一種很好的方法.CHIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用,還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系.而且,CHIP與其他方法的結(jié)合,擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合,用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用.
一般ChIP的流程是：甲醛處理細(xì)胞---收集細(xì)胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合---加入ProteinA,結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物,并沉淀---對(duì)沉淀下來(lái)的復(fù)合物進(jìn)行清洗,除去一些非特異性結(jié)合---洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物---解交聯(lián),純化富集的DNA-片斷---PCR分析.
在PCR分析這一塊,比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR.但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及,大家也越來(lái)越傾向于Q-PCR了.此外還有一些由ChIP衍生出來(lái)的方法.例如RIP（其實(shí)就是用ChIP的方法研究細(xì)胞內(nèi)蛋白與RNA的相互結(jié)合,具體方法和ChIP差不多,只是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意防止RNase,最后分析的時(shí)候需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實(shí)就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基礎(chǔ)上有所改變,不同的公司有不同的做法,要根據(jù)公司的要求來(lái)準(zhǔn)備樣品）.
第一天：
（一）、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎.
1、取出1平皿細(xì)胞（10cm平皿）,加入243 ul 37％甲醛,使得甲醛的終濃度為1％（培養(yǎng)基共有9ml）.
2、37攝氏度孵育10min.
3、終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125M.450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中.混勻后,在室溫下放置5min即可.
4、吸盡培養(yǎng)基,用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次.
5、細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15ml離心管中（PBS依次為5ml,3ml和3ml）.預(yù)冷后2000rpm 5min收集細(xì)胞.
6、倒去上清.按照細(xì)胞量,加入SDS Lysis Buffer.使得細(xì)胞終濃度為每200ul含2×106個(gè)細(xì)胞.這樣每100ul溶液含1×106個(gè)細(xì)胞.再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物.假設(shè)MCF7長(zhǎng)滿板為5×106個(gè)細(xì)胞.本次細(xì)胞長(zhǎng)得約為80％.即為4×106個(gè)細(xì)胞.因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer.將2管混在一起,共800ul.
7、超聲破碎：VCX750,25％功率,4.5S沖擊,9S間隙.共14次.
（二）、除雜及抗體哺育.
8、超聲破碎結(jié)束后,10,000g 4oC離心10min.去除不溶物質(zhì).
留取300ul做實(shí)驗(yàn),其余保存于-80oC.
300ul中,100ul加抗體做為實(shí)驗(yàn)組；100ul不加抗體做為對(duì)照組；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M）,65oC處理3h解交聯(lián),跑電泳,檢測(cè)超聲破碎的效果.
9、在100ul的超聲破碎產(chǎn)物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC.
再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA.4oC顛轉(zhuǎn)混勻1h.
10、1h后,在4oC靜置10min沉淀,700rpm離心1min.
11、取上清.各留取20ul做為input.一管中加入1ul抗體,另一管中則不加抗體.4oC顛轉(zhuǎn)過(guò)夜.
（三）、檢驗(yàn)超聲破碎的效果.
取100ul超聲破碎后產(chǎn)物,加入4ul5MNaCl,65oC處理2h解交聯(lián).分出一半用酚/氯仿抽提.電泳檢測(cè)超聲效果.
第二天：
（一）、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗.
12、孵育過(guò)夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA.4oC顛轉(zhuǎn)2h.
13、4oC靜置10min后,700rpm離心1min.除去上清.
14、依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物.清洗的步驟：加入溶液,在4oC顛轉(zhuǎn)10min,4oC靜置10min沉淀,700rpm離心1min,除去上清.
洗滌溶液：a.low salt wash buffer-one wash
b.highsalt wash buffer-one wash
c.LiCl wash buffer-one wash
d.TE buffer-two wash
15、清洗完畢后,開(kāi)始洗脫.洗脫液的配方：100ul10％SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml.
每管加入250ul洗脫buffer,室溫下顛轉(zhuǎn)15min,靜置離心后,收集上清.重復(fù)洗滌一次.最終的洗脫液為每管500ul.
16、解交聯(lián)：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）.
混勻,65oC解交聯(lián)過(guò)夜.
第三天：
（一）、DNA樣品的回收
17、解交聯(lián)結(jié)束后,每管加入1ulRNaseA（MBI）,37oC孵育1h.
18、每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl（PH6.5）,2ul10mg/ml蛋白酶K.
45oC處理2h.
19、DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒.最終的樣品溶于100ulddH2O.
（二）、PCR分析