最適測(cè)定條件與條件的優(yōu)化
國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IFCC）和中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)均推薦選擇在“最適條件”下測(cè)定酶活性濃度.所謂最適條件是指能滿足酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度所需的條件.包括：①合適的底物和最適底物濃度；②理想的緩沖液種類(lèi)和最適離子強(qiáng)度；③反應(yīng)液的最適pH；④最適反應(yīng)溫度；⑤合適的輔因子、激活劑濃度；⑥若是酶偶聯(lián)反應(yīng),還需要確定指示酶和輔助酶的用量；⑦合理的測(cè)定時(shí)間,包括延滯期盡量短暫,有足夠的線性期；⑧合適的樣品與反應(yīng)試劑的比例；⑨足夠的檢測(cè)范圍；⑩盡量去除各種抑制劑等.
1．底物濃度 除選擇適合的底物外,在實(shí)際應(yīng)用中更多考慮的是底物濃度.由于[S]與反應(yīng)速度V成雙曲線關(guān)系,在酶活性測(cè)定時(shí),要求[S]達(dá)到一定水平以保證酶活性與酶量成正比.[S]范圍一般選擇在10～20Km為宜,此時(shí)反應(yīng)速度基本達(dá)到最大反應(yīng)速度,測(cè)定的誤差在可接受范圍.
2．酶濃度 在反應(yīng)條件一定時(shí),酶濃度與反應(yīng)速度成正比.按照中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō),只有[S]>>[E]時(shí),酶才能被底物分子飽和,反應(yīng)速度才能達(dá)到最大值.因此當(dāng)標(biāo)本酶活力過(guò)高時(shí),應(yīng)將標(biāo)本適當(dāng)稀釋后再加以測(cè)定.
3．溫度 不同的酶最適溫度可以不同,多數(shù)酶的最適溫度在37～40℃,高于或低于最適溫度,酶活性都降低.目前,酶活性的測(cè)定溫度尚未統(tǒng)一,但常規(guī)實(shí)驗(yàn)室多使用37℃.溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響程度通常用溫度系數(shù)(Q10)表示.溫度系數(shù)指溫度每升高10℃,化學(xué)反應(yīng)速度增加的倍數(shù).Q10通常為l～2.由溫度系數(shù)得知,溫度的變化對(duì)酶活性有著重要影響,因此要求酶活性測(cè)定要在恒溫條件下進(jìn)行,溫度波動(dòng)要控制在±1℃.
4．離子強(qiáng)度和pH值 在最適pH時(shí),酶的活性最強(qiáng),高于或低于最適pH,酶的活性都降低,多數(shù)酶的最適pH在5～8之間.在測(cè)定酶活性時(shí),要求緩沖液具有足夠的緩沖容量,以便使pH值保持穩(wěn)定.血漿或血清標(biāo)本含有多種緩沖溶質(zhì),具有較強(qiáng)的緩沖能力.為了防止血漿或血清標(biāo)本緩沖溶質(zhì)對(duì)反應(yīng)液酸堿度的影響,使pH不致偏離設(shè)定值,標(biāo)本用量不宜過(guò)大,血漿或血清標(biāo)本體積／反應(yīng)液體積≤1／10為宜.
5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類(lèi)輔酶是結(jié)合酶的輔助因子,例如Zn2+是羧基肽酶的輔基,Mo6+是黃嘌呤氧化酶的輔基,NADH是不需氧脫氫酶的輔酶.這些酶離開(kāi)它們的輔基或輔酶就不能表現(xiàn)活性,因此在酶活性測(cè)定時(shí),就要保證輔基或輔酶的供給.
6．激活劑 有些酶在有激活劑存在時(shí)才有活性或活性較高,例如Mg2+是肌酸激酶的激活劑,Cl-是淀粉酶的激活劑.因此在酶活性測(cè)定時(shí),也要滿足酶對(duì)激活劑的需要.
7．抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制,后者又可分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制.重金屬離子和砷化物對(duì)巰基酶的抑制、有機(jī)磷對(duì)羥基酶的抑制屬于不可逆抑制；丙二酸對(duì)琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類(lèi)藥物對(duì)二氫葉酸合成酶的抑制屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制；哇巴因?qū)a+,K+-ATP酶的抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制.抑制劑使酶活性降低,在測(cè)定酶活性時(shí),應(yīng)避免抑制劑的影響.
綜上所述,測(cè)定酶活性時(shí),最適條件的選擇應(yīng)該遵循最適底物濃度、最適溫度、最適pH值、滿足輔助因子和激活劑、避免抑制劑的原則.