CTAB提取植物DNA中的問題
我提取的是植物的DNA,其中步驟是這樣的.
1.稱取材料0.2g,加入適量PVP,500µl冰冷CTAB,20µl冰冷RNA酶研磨；
2.研磨后加入500µl加熱的CTAB,裝入1.5ml離心管中；
3.充分混勻后,65℃水浴1h,期間不時輕緩震蕩；
4.12000rpm離心10min,取750µl上清液至另一離心管中；
5.加入等體積的Tris飽和酚,搖勻后12000rpm離心10min；
6.取600µl上清液至另一離心管中,加入等體積的氯仿·飽和酚（1:1）,搖勻；
7.12000rpm離心10min,取500µl上清液至另一離心管中；
9.加入等體積氯仿·異戊醇（24:1）,搖勻后12000rpm離心10min；
9.取450µl上清液至另一離心管中,加入等體積異丙醇；
10.-20℃防止1h或室溫下過夜；
11.12000rpm離心10min,倒棄上清液；70%冰冷乙醇洗滌沉淀2次；
12.倒棄上清液,風(fēng)干沉淀；
14.加100µlTE溶解DNA,-20℃保存?zhèn)溆?
就是到第6步的時候,出現(xiàn)了一個比較嚴(yán)重的問題,就是上層清液根本就是油狀的,取出來進(jìn)行下一個步驟的時候上清液就很少量了.
我自己覺得有兩個原因：
1.Tris飽和酚應(yīng)該使用上層還是下層,還是混勻后使用?
2.離心的轉(zhuǎn)速或時間是否不合理?
酚和氯仿異戊醇（25:24:1）是怎樣配置的？配置的時候是將飽和酚搖勻后傾倒配置還是只取下層飽和酚溶液使用？
這個份氯仿異戊醇可以放置很久嗎？還是要求現(xiàn)配先用？
取下層的水相使用是為什么，那就是酚氯仿異戊醇配好后也會分層是嗎？