2,上游引物設(shè)計(jì)：選取正向5’-3’的基因序列約23bp左右,copy下來；在這段序列的5’端加上你的上游酶切位點(diǎn)（一般6bp）,再在之前加入兩個(gè)任意堿基作為保護(hù)堿基；序列為：保護(hù)堿基（2bp）+上游酶切位點(diǎn)（6bp）+基因起始序列5’-3’,引物堿基總長(zhǎng)約28-30bp.
3,下游引物設(shè)計(jì)：將序列反相互補(bǔ),得到互補(bǔ)鏈序列,選取5’-3’的基因序列約20bp左右,同樣在5’端加上下游酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；一般情況下還需要在酶切位點(diǎn)和基因之間加上stop codon.序列為：保護(hù)堿基（2bp）+下游酶切位點(diǎn)（6bp）+stop codon(3bp)+基因互補(bǔ)序列起始序列5’-3’,引物堿基總長(zhǎng)約28-30bp
4,檢查：（1）引物長(zhǎng)度；（2）上游酶切位點(diǎn)是否移碼,如果移碼,則應(yīng)增加1-2個(gè)堿基恢復(fù)讀碼框；（3）如果下游沒有設(shè)計(jì)終止密碼子,也應(yīng)檢測(cè)是否移碼,PCR能否順利終止,不行則休正；（4）退火溫度,一對(duì)引物的退火溫度不能相差太大,否則應(yīng)調(diào)節(jié)堿基使之滿足要求.