RT-PCR融解曲線詳解
RT-PCR融解曲線詳解
生物人氣:275 ℃時(shí)間:2020-04-13 11:12:22
優(yōu)質(zhì)解答
融解曲線是熒光定量PCR儀出現(xiàn)后為了考察染料法結(jié)果的特異性產(chǎn)生的.大家使用熒光定量PCR的目的(也是熒光定量PCR的宣稱優(yōu)點(diǎn))有快速、準(zhǔn)確及無污染,其中快速的前提之一是不用跑電泳就可以通過擴(kuò)增曲線考察初始拷貝數(shù)的量;準(zhǔn)確是因?yàn)殡娪臼墙K產(chǎn)物,而通過擴(kuò)增曲線我們知道,擴(kuò)增最后達(dá)到平臺(tái)期,這時(shí)不能真實(shí)反映未知樣品的初始濃度,通過實(shí)驗(yàn)證明,擴(kuò)增曲線的指數(shù)擴(kuò)增期可以進(jìn)行定量(Ct值);無污染是電泳需要開蓋操作,而熒光定量PCR通過擴(kuò)增曲線就不需要跑電泳就可以定量了.融解曲線是由于染料法的特異性差,所以通過融解曲線考察擴(kuò)增產(chǎn)物是否是目標(biāo)產(chǎn)物,與電泳的其中的一個(gè)目的相同,但融解曲線畢竟是數(shù)學(xué)推導(dǎo),并且結(jié)果中包含了儀器的誤差(熒光信號(hào)中有系統(tǒng)誤差),不如電泳能反映更多的實(shí)際的信息.所以實(shí)驗(yàn)時(shí),如果采用染料法,融解曲線較好的話,如果實(shí)驗(yàn)條件不允許,可以不做電泳了,但如果融解曲線出現(xiàn)問題,借助電泳分析是一個(gè)很好的手段(有時(shí)擴(kuò)增曲線顯示沒有擴(kuò)增,但有電泳結(jié)果,可能的原因是設(shè)置問題或者染料、探針本省或者量的問題),個(gè)人認(rèn)為比融解曲線更可靠.如果發(fā)文章,有融解曲線并且有電泳圖,就比較完美了.
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