PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間 　　一般為48h以內(nèi),有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè),大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失.
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及, ④PCR循環(huán)條件.尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究.
酶切分析：
根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn),用相應(yīng)的酶切、電泳分離后,獲得符合理論的片段,此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定,又能對(duì)靶基因分型,還能進(jìn)行變異性研究. 　　分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù),也是檢測(cè)PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法. 　　Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針,與PCR產(chǎn)物雜交.此法既可作特異性鑒定,又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度,還可知其分子量及條帶形狀,主要用于科研. 　　斑點(diǎn)雜交： 將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上,再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交,觀察有無(wú)著色斑點(diǎn),主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析. 　　氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀 核酸.提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng).一般臨床檢測(cè)標(biāo)本,可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴(kuò)增.RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
溫度與時(shí)間的設(shè)置： 　　基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn).在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).
實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一.因此,不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真,在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
1. 戴一次性手套,若不小心濺上反應(yīng)液,立即更換手套；
2. 使用一次性吸頭,嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用,吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染；
3. 避免反應(yīng)液飛濺,打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體于管底.若不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時(shí),制備反應(yīng)混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應(yīng)的精確度；
5. 最后加入反應(yīng)模板,加入后蓋緊反應(yīng)管；
6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照,即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性,又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染,最好使用可替換或高壓處理的加樣器.如沒(méi)有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專用,不能交叉使用,尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；
8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證結(jié)果,慎下結(jié)論.