第五章 微生物的生長繁殖及其控制
重點(diǎn)：細(xì)菌生長曲線的定義、各時(shí)期的特點(diǎn)、應(yīng)用及生產(chǎn)指導(dǎo)意義.控制微生物生長繁殖及控制微生物生長的條件及原理.
微生物在適宜的環(huán)境條件下,不斷地吸收營養(yǎng)物質(zhì),并按照自己的代謝方式進(jìn)行代謝活動(dòng),如果同化作用大于異化作用,則細(xì)胞質(zhì)的量不斷增加,體積得以加大,于是表現(xiàn)為生長.簡單地說,生長就是有機(jī)體的細(xì)胞組分(constituent)與結(jié)構(gòu)在量方面的增加.單細(xì)胞微生物如細(xì)菌,生長往往伴隨著細(xì)胞數(shù)目的增加.當(dāng)細(xì)胞增長到一定程度時(shí),就以二分裂方式,形式兩個(gè)基本相的子細(xì)胞,子細(xì)胞又重復(fù)以上過程.在單細(xì)胞微生物中,由于細(xì)胞分裂而引起的個(gè)體數(shù)目的增加,稱為繁殖.在多細(xì)胞微生物中,如某些霉菌,細(xì)胞數(shù)目的增加如不伴隨著個(gè)體數(shù)目的增加,只能叫生長,不能叫繁殖.例如菌絲細(xì)胞的不斷延長或分裂產(chǎn)生同類細(xì)胞均屬生長,只有通過形成無性孢子或有性孢子使得個(gè)體數(shù)目增加的過程才叫做繁殖.
在一般情況下,當(dāng)環(huán)境條件適合,生長與繁殖始終是交替進(jìn)行的.從生長到繁殖是一個(gè)由量變到質(zhì)變的過程,這個(gè)過程就是發(fā)育.
微生物處于一定的物理、化學(xué)條件下,生長、發(fā)育正常,繁殖速率也高；如果某一或某些環(huán)境條件發(fā)生改變,并超出了生物可以適應(yīng)的范圍時(shí),就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生抑制乃至殺滅作用.
第一節(jié)細(xì)菌純培養(yǎng)的群體生長規(guī)律
大多數(shù)細(xì)菌的繁殖速度都很快.大腸桿菌的適宜條件下,每20分鐘左右便可分裂一次,如果始終保持這樣的繁殖速度,一個(gè)細(xì)菌48個(gè)小時(shí)內(nèi),其子代總重量可達(dá)2.2×10 31克,這是一個(gè)巨大的數(shù)字.然而,實(shí)際情況是不可能的.那么,細(xì)菌的群體生長規(guī)律到底怎樣呢?
一、細(xì)菌純培養(yǎng)的群體生長規(guī)律（詳細(xì)講解,讓學(xué)生理解并掌握）
將少量單細(xì)胞純培養(yǎng)接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中,在適宜的條件下培養(yǎng),定時(shí)取樣測定細(xì)菌含量,可以看到以下現(xiàn)象：開始有一短暫時(shí)間,細(xì)菌數(shù)量并不增加,隨之細(xì)菌數(shù)目增加很快,繼而細(xì)菌數(shù)又趨穩(wěn)定,最后逐漸下降.如果以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)或生長速度為縱坐標(biāo)作圖,可以得到如圖6-6的曲線,稱為繁殖曲線,對(duì)單細(xì)胞微生物而言,雖然生長和繁殖是兩個(gè)不同的概念,但由于在測定方法上,多以細(xì)菌數(shù)增加(即繁殖)作為生長指標(biāo),它們的繁殖也可視為群體的生長,所以,繁新的適宜的環(huán)境中生長繁殖直至衰老死亡全過程的動(dòng)態(tài)變化.根據(jù)細(xì)菌生長繁殖速率的不同,可將生長曲線大致分為延遲期、對(duì)數(shù)期、調(diào)整期或滯留適應(yīng)期.
（一）延遲期 處于延遲期細(xì)菌細(xì)胞的特點(diǎn)可概括為8個(gè)字：分裂遲緩、代謝活躍.細(xì)胞體積增長較快,尤其是長軸,例如巨大芽孢桿菌,在延遲期末,細(xì)胞平均長度比剛接種時(shí)大6倍以上；細(xì)胞中RNA含量增高,原生質(zhì)嗜堿性加強(qiáng)；對(duì)不良環(huán)境條件較敏感,對(duì)氧的吸收、二氧化碳的釋放以及脫氨作用也很強(qiáng),同時(shí)容易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶等.這些都說明細(xì)胞處于活躍生長中,只是細(xì)胞分裂延遲.在此階段后期,少數(shù)細(xì)胞開始分裂,曲線略有上升.
延遲期出現(xiàn)的原因,可能是為了調(diào)整代謝.當(dāng)細(xì)胞接種到新的環(huán)境(如從固體培養(yǎng)接種至液體培養(yǎng)基)后,需要重新合成必需量的酶、輔酶或某些中間代謝產(chǎn)物,以適應(yīng)新的環(huán)境.
延遲期的長短與菌種的遺傳性、菌齡以及移種前后所處的環(huán)境條件等因素有關(guān),短的只需幾分鐘,長的可達(dá)幾小時(shí).因此,深入了解延遲期產(chǎn)生的原因,采取縮短延遲期的措施,在發(fā)酵工業(yè)上具有十分重要的意義.在生產(chǎn)實(shí)踐中,通常采取的措施有增加接種量,在種子培養(yǎng)中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些營養(yǎng)成分,采用最適種齡(即處于對(duì)數(shù)期的菌種)的健壯菌種接種以及選用繁殖快的菌種等措施,以縮短延遲期,加速發(fā)酵周期,提高設(shè)備利用率.
在延遲期末,每個(gè)細(xì)胞已開始分裂,但并非所有的機(jī)體都同時(shí)結(jié)束這一時(shí)期,所以細(xì)菌數(shù)逐漸增加,曲線稍有上升,直至這一階段結(jié)束,進(jìn)入下一階段.
(二) 對(duì)數(shù)期(log phase) 對(duì)數(shù)期又稱指數(shù)期(exponential phase).在此期中,細(xì)胞代謝活性最強(qiáng),組成新細(xì)胞物質(zhì)最快,所有分裂形成的新細(xì)胞都生活旺盛.這一階段的突出特點(diǎn)是細(xì)菌數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增加,代時(shí)穩(wěn)定,細(xì)菌數(shù)目的增加與原生質(zhì)總量的增加,與菌液混濁度的增加均呈正相關(guān)性.這時(shí),細(xì)菌純培養(yǎng)的生長速率也就是群體生長的速率,可用代時(shí)(generation time)表示.所謂代時(shí),即單個(gè)細(xì)胞完成一次分裂所需的時(shí)間,亦即增加一代所需的時(shí)間(也叫增代時(shí)間或世代時(shí)間).在此階段,由于代時(shí)穩(wěn)定,因此,只要知道了對(duì)數(shù)期中任何兩個(gè)時(shí)間的菌數(shù),就可求出細(xì)菌的代時(shí).
不同的細(xì)菌,其對(duì)數(shù)期的代時(shí)不同,同一種細(xì)菌,由于培養(yǎng)基組成和物理?xiàng)l件的影響,如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH、營養(yǎng)物的性質(zhì)等,代時(shí)也不相同.但是,在一定條件下,各種菌的代時(shí)又是相對(duì)穩(wěn)定的,多數(shù)種為20-30分鐘,有的長達(dá)33小時(shí),而有的繁殖極快,增代時(shí)間只9.8分左右.表6-4示不同細(xì)菌的代時(shí).
處于對(duì)數(shù)期的微生物,其個(gè)體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等均較一致,代謝旺盛,生長迅速,代時(shí)穩(wěn)定,所以是研究基本代謝的良好材料,也是發(fā)酵生產(chǎn)的良好種子,如果用作菌種,往往延遲期很短以至檢查不出,這樣可在短時(shí)間內(nèi)得到大量微生物,以縮短發(fā)酵周期.
(三) 穩(wěn)定期(stationary phase) 又稱恒定期或最高生長期.處于穩(wěn)定期的微生物,新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等,整個(gè)培養(yǎng)物中二者處于動(dòng)態(tài)平衡,此時(shí)生長速度,又逐漸趨向零.
在一定容積的培養(yǎng)基中,細(xì)菌為什么不能按對(duì)數(shù)期的高速率無限生長呢?這是由于對(duì)數(shù)期細(xì)菌活躍生長引起周圍環(huán)境條件條件發(fā)生了一系列變化,某些營養(yǎng)物質(zhì)消耗,有害代謝產(chǎn)物的積累,以及諸如pH、氧化還原電位、溫度等的改變,限制了菌體細(xì)胞繼續(xù)以高速度進(jìn)行生長和分裂.
此階段初期,細(xì)菌分裂的間隔時(shí)間開始延長,曲線上升逐漸緩慢.隨后,部分細(xì)胞停止分裂,少數(shù)細(xì)胞開始死亡,致使細(xì)胞的新生與死亡速率處于動(dòng)態(tài)平衡.這時(shí)培養(yǎng)物中細(xì)胞總數(shù)達(dá)到最高水平,接著死亡細(xì)胞數(shù)大大超過新增殖細(xì)胞數(shù),曲線出現(xiàn)下降趨勢.
穩(wěn)定期的細(xì)胞內(nèi)開始積累貯藏物,如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等,大多數(shù)芽孢細(xì)菌也在此階段形成芽孢.如果為了獲得大量菌體,就應(yīng)在此階段收獲,因這時(shí)細(xì)胞總數(shù)量最高；這一時(shí)期也是發(fā)酵過程積累代謝產(chǎn)物的重要階段,某些放線菌抗生素的大量形成也在此時(shí)期.
從上可以看出,穩(wěn)定期的微生物,在數(shù)量上的達(dá)到了最高水平,產(chǎn)物的積累也達(dá)到了高峰,此時(shí),菌體的總產(chǎn)量與所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)之間存在著一定關(guān)系,這種關(guān)系,生產(chǎn)上稱為產(chǎn)量常數(shù),可用下式表示：
γ=菌體總生長量/消耗營養(yǎng)物質(zhì)總量
式中γ值的大小可說明該種細(xì)菌同化效率的高低.根據(jù)這一原理,可用適當(dāng)?shù)奈⑸镒鳛橹甘?對(duì)維生素、氨基酸或核苷酸等進(jìn)行定量的生物測定.穩(wěn)定期的長短與菌種和外界環(huán)境條件有關(guān).生產(chǎn)上常常通過補(bǔ)料、調(diào)節(jié)pH、調(diào)整溫度等措施,延長穩(wěn)定期,以積累更多的代謝產(chǎn)物.
(四) 衰亡期(decline hpase) 穩(wěn)定期后如再繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)菌死亡率逐漸增加,以致死亡數(shù)大大超過新生數(shù),群體中活菌數(shù)目急劇下降,出現(xiàn)了"負(fù)生長",此階段叫衰亡期.其中有一段時(shí)間,活菌數(shù)換幾何級(jí)數(shù)下降,故有人稱之為"對(duì)數(shù)死亡階段".這一階段的細(xì)胞,有的開始自溶,產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物,如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等.菌體細(xì)胞也呈現(xiàn)多種形態(tài),有時(shí)產(chǎn)生畸形,細(xì)胞大小懸殊,有的細(xì)胞內(nèi)多液泡,革蘭氏染色反應(yīng)的陽性菌變成陰性反應(yīng)等.在學(xué)習(xí)細(xì)菌生長曲線的有關(guān)知識(shí)時(shí),應(yīng)注意各生長期之間的過渡階段.從圖6-6可以看到培養(yǎng)物是逐步地從一個(gè)生長期進(jìn)入到下了個(gè)生長期的.也就是說,并不是所有細(xì)胞在接近某一生長期的末尾時(shí)均處于完全相同的生理狀態(tài),因此,在細(xì)菌生長的整個(gè)周期,細(xì)菌數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間,若以線性關(guān)系表示,往往是一條緩慢上升以后又逐漸下降的曲線,而不是一個(gè)階段分明的直線.
認(rèn)識(shí)和掌握細(xì)菌生長曲線,不僅對(duì)指導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)具有很大作用,而且對(duì)科學(xué)研究也是十分必要的.例如,為了得到研究材料,往往少不了要預(yù)計(jì)一細(xì)胞群體生長到一定數(shù)量水平需要多長時(shí)間,這就必須計(jì)算生長速率和代時(shí).另外,正確認(rèn)識(shí)正常生長曲線的完整意思也很重要,在某個(gè)生長時(shí)期細(xì)胞年幼而代謝活躍,哪個(gè)時(shí)期細(xì)胞老化并瀕于死亡,因不同生長期的細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和生理上可能有很大差別,了解了這些,就能根據(jù)需要進(jìn)取樣和收獲.同時(shí),在不同的生長期里理化因子對(duì)微生物的影響了可能不同.一般來說,對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞較為一致,因此常用于研究細(xì)胞的新陳代謝.
二、微生物生長的測定（詳細(xì)講解,讓學(xué)生理解）
微生物特別是單細(xì)胞微生物,體積很小,個(gè)體的生長很難測定,而且也沒有什么實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.因此,測定它們的生長不是依據(jù)細(xì)胞個(gè)體的大小,而是測定群體的增加量,即群體的生長.例如用直接或間接的方法測定群體的增加量；或測定群體的原生質(zhì)量；或測定細(xì)胞中某些生理活性的變化等.就一般單細(xì)胞微生物而言,尤其在對(duì)數(shù)生長期,像細(xì)菌的生長量與細(xì)菌的數(shù)目之間完成是一種正比例關(guān)系.因此,某些情況下,細(xì)菌的數(shù)目就表示了它的生長量.測定生長量的方法很多,概括起來有以下幾種.
(一) 直接計(jì)數(shù)法(又稱全數(shù)法)
1. 涂片染色法 將已知體積的待測材料,均勻地涂布在載玻片的已知面積上,經(jīng)固定染色后,在顯微鏡下計(jì)算染色涂片上的細(xì)菌數(shù).一般在載玻片一平方厘米的面積上,均勻涂布0.01毫升樣品.很顯然,在顯微鏡下要觀察整個(gè)涂布區(qū)域是較困難的,因此,人們常常任意選擇幾個(gè)乃至十幾個(gè)視野來計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量.如果借助鏡臺(tái)測微尺測得視野的直徑,就可計(jì)算了.視野的面積(面積=πr2,r為視野的半徑),然后用一平方厘米內(nèi)的視野數(shù)乘以每個(gè)視野中的細(xì)胞平均數(shù),再乘以100(因只用了0.01毫升樣品涂布),就等于每毫升菌液的細(xì)胞數(shù).其計(jì)算公式如下：
每毫升原菌液含菌數(shù)=視野中的平均菌數(shù)×1cm 2/視野面積×100×稀釋倍數(shù)
2.計(jì)數(shù)器測定法 用特制的細(xì)菌計(jì)數(shù)器或血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù).取一定容積稀釋的單細(xì)胞微生物懸液置于計(jì)數(shù)器載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室內(nèi).由于計(jì)數(shù)室的容積是己知的(總面積為1平方毫米,高0.1毫米),并有一定刻度.因此,可根據(jù)計(jì)數(shù)器刻度內(nèi)的細(xì)菌數(shù),計(jì)算出樣品中的含菌數(shù).
根據(jù)計(jì)數(shù)器小格數(shù)目的不同,可概括成兩個(gè)換算公式：
(1) 16個(gè)中格×25個(gè)小格的計(jì)數(shù)器：每毫升原菌液含菌數(shù)=100小格內(nèi)菌數(shù)100×400×10,000×稀釋倍數(shù)
(2) 25個(gè)中格×16個(gè)小格的計(jì)數(shù)器：每毫升原菌液含菌數(shù)=小格內(nèi)菌數(shù)80×400×10：000×稀釋倍數(shù)
上述兩種計(jì)數(shù)器有一個(gè)共同特點(diǎn),即每一個(gè)大方格均由16×25=400個(gè)小方格組成,故可將上面兩個(gè)公式歸納成一個(gè)通式：
每毫升原菌液含菌數(shù)=每小格平均菌數(shù)×4,000,000×稀釋倍數(shù)
3.比例計(jì)數(shù)法 將待測的細(xì)菌懸液與等體積血液混合后涂片,在顯微鏡下可以測得細(xì)菌數(shù)與紅細(xì)胞數(shù)的比例.由于每毫升血液中紅細(xì)胞數(shù)是已知的,如正常的男性每立方毫米血液中約含400-500萬個(gè),女性約為350-450萬個(gè).這樣,通過細(xì)菌數(shù)與紅細(xì)胞數(shù)的比例,就可計(jì)算出每毫升樣品中的細(xì)菌數(shù).如果測定空氣和水中的微生物時(shí),由于含菌數(shù)低,需將一定體積的樣品通過特制的濾器進(jìn)行濃縮.
上述三種方法都屬于顯微鏡直接計(jì)數(shù)法.這些方法雖然較麻煩,但在許多有關(guān)微生物生長的研究工作中卻很重要.然而也有一定的局限性,主要表現(xiàn)在：死、活細(xì)胞不易區(qū)分；小的細(xì)胞很難在顯微鏡下觀察,有一些細(xì)胞可能被遺漏；濃度太低的細(xì)胞懸液也不能使用此法,可以計(jì)數(shù)的最低的群體細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞大小有關(guān),就大多靈敏細(xì)菌而言,群體數(shù)必須每毫升懸液中含菌10 6個(gè)以上；精確性也較差.
4.電子自動(dòng)計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法 電子計(jì)數(shù)器的工作原理,就是測定一個(gè)小孔中液體的電阻變化.
電子自動(dòng)計(jì)數(shù)器具有一個(gè)特制的有孔玻璃薄膜,當(dāng)定量的細(xì)胞懸液中的菌體高速地通過小孔時(shí),由于懸液與菌體的導(dǎo)電性不同,使得小孔的電導(dǎo)下降,電阻強(qiáng)率明顯增加,并形成一個(gè)脈沖,自動(dòng)記錄在電子記錄尺標(biāo)裝置上.這樣,一份已知體知的含有待測細(xì)胞的菌懸液,讓其通過這一小孔,每當(dāng)一個(gè)細(xì)胞通過時(shí)就就產(chǎn)一個(gè)脈沖被記錄下來.此設(shè)備可以高速測定菌數(shù),而且結(jié)果也較精確.但是電子計(jì)數(shù)器不能區(qū)別其他顆粒,因此,菌懸液中應(yīng)無其他碎片.
5.比濁法 這是測定懸液中細(xì)胞數(shù)的快速方法.其原理是懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比,與透光度成反比.菌體是不透光的,光速通過菌懸液時(shí)則會(huì)引起光的散射或吸收,從而降低透光量.細(xì)菌越多,透光量越低.因此,測定菌懸液的光密度或透光度可以反映細(xì)胞的濃度.而光密度或透光度又可借光電池精確地測得.然后將未知細(xì)胞數(shù)的懸液與已知細(xì)胞數(shù)的懸
液相比,可以從已知懸液的稀釋倍數(shù),求出未知懸液所含的細(xì)胞數(shù).此法比較簡便.但使用時(shí)必須注意：樣品顏色不宜太深；樣品中不要混雜其他物質(zhì),否則不能使用；同時(shí)菌懸液濃度必須在10 7/毫升以上才能顯示可信的混濁度.
(二) 間接計(jì)數(shù)法(又叫活菌計(jì)數(shù)法)
直接計(jì)數(shù)法測定的是死、活細(xì)胞總數(shù).在多數(shù)情況下,人們所關(guān)心的是計(jì)算活菌數(shù).間接計(jì)數(shù)法是基于每個(gè)分散的有機(jī)體在適宜的培養(yǎng)基中具有生長繁殖的能力,并且一個(gè)活細(xì)胞能形成一個(gè)菌藩.因此,菌落數(shù)就是待測樣品的含的活菌數(shù).此法所得的數(shù)值往往比直接法測定的數(shù)字小.
1.平皿菌落計(jì)數(shù)法 像稀釋平皿分離法一樣,先將待測菌液作一系列10倍稀釋,使平皿上長出的菌落數(shù)在30-300個(gè)之間.然后將最后三個(gè)稀釋度的稀釋液各取一定量(一般為0.2毫升)與融化并冷至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基一起,傾入無菌平皿中搖勻,靜置,待凝固后進(jìn)行保溫培養(yǎng),通過平皿上出現(xiàn)的菌落數(shù),便可推算出原菌液含菌數(shù).計(jì)算公式：
總活菌數(shù)/毫升=同一稀釋度三次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5
此法由于個(gè)人掌握程度的不同,結(jié)果常不穩(wěn)定.其成敗關(guān)鍵在于應(yīng)使樣品充分均勻,而且每個(gè)稀釋度的菌液應(yīng)各用一支無菌吸管,以減少吸管壁因存在油脂等物粘上細(xì)菌而影響計(jì)數(shù)的精確度(否則,有時(shí)誤差高達(dá)15%左右).為克服這一弱點(diǎn),近年來有人對(duì)此法作了改進(jìn).他們認(rèn)為,對(duì)原菌液濃度為10-9/毫升的微生物來說,如果第一次稀釋采用10-4級(jí)(即用毛細(xì)吸管吸菌液10微升至100毫升的無菌水中),第二次稀釋則采用10-2級(jí)(即吸1毫升上述稀釋菌液于100毫升無菌水中),然后再吸0.2毫升此菌液進(jìn)行平皿菌落計(jì)數(shù)(采用表面涂布法),其結(jié)果較為精確可靠(圖6-4).
平皿菌落計(jì)數(shù)法是教學(xué)、生產(chǎn)、科研中最常見的一種活菌計(jì)數(shù)法.它不僅適用于多種材料,而且,即使樣品中含菌數(shù)量極少也可以測出.常用于測定水、土壤、牛奶、食品及其他材料中的活菌數(shù).必須注意的是：并非所有生活有機(jī)體都要在實(shí)驗(yàn)條件下或?qū)嶒?yàn)期間內(nèi)生長并形成菌落,如果在待測樣品中含有不同生理類型的有機(jī)體時(shí)更是如此.此外,意外的損傷也可導(dǎo)致菌數(shù)減少,例如有些細(xì)菌,可能在稀釋和傾倒平皿等過程中遭到損傷,造成人為的誤差.處于融化狀態(tài)的瓊脂培養(yǎng)基溫度較高,某些易受熱力影響的微生物往往不能存活；加之人們無法看出產(chǎn)生菌落細(xì)胞,因而不能絕對(duì)肯定一個(gè)菌落僅來源于一個(gè)細(xì)胞,以致造成實(shí)驗(yàn)誤差.
2.稀釋法 獎(jiǎng)待測樣品作一系列稀釋,一直稀釋到該稀釋液的少量(如1毫升)接種到新鮮培養(yǎng)基中沒有或極少出現(xiàn)生長繁殖.根據(jù)沒有生長的最低稀釋度與出現(xiàn)生長的最高稀釋度(即臨界級(jí)數(shù)),再用"或然率"理論,可以計(jì)算出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值.具體的說,菌液經(jīng)多次稀釋后,一定量菌液中可以極少甚至無菌,然后將待測液于液體培養(yǎng)基中,按十倍稀釋度作一系列稀釋,每個(gè)稀釋度取3-5次重復(fù),培養(yǎng)后,將有細(xì)胞生長的最的三個(gè)稀釋度中的出現(xiàn)細(xì)菌生長的管數(shù)作為數(shù)量指示,由統(tǒng)計(jì)分配表(表6-2)上查出近似值,再乘以數(shù)量指標(biāo)第一位數(shù)的稀釋倍數(shù),即為原菌液中的含菌數(shù).例如：某一細(xì)菌在稀釋法中的生長情況如下：
根據(jù)上述結(jié)果,其數(shù)量指標(biāo)為"541",查統(tǒng)計(jì)分配表得近似值為17.然后乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)(10-5的稀釋倍數(shù)為100,000).那么,原菌液中的活菌數(shù)=17×100,000=10 5.即每毫升原菌液中含活菌為1,700,000個(gè).統(tǒng)計(jì)分配表根據(jù)重復(fù)次數(shù)不同分為三次重復(fù)測數(shù)統(tǒng)計(jì)表,四次重復(fù)測數(shù)統(tǒng)計(jì)表和五次重復(fù)測數(shù)統(tǒng)計(jì)表(又稱五管最或然數(shù)表).
在實(shí)踐中,通常以五管重復(fù)為一個(gè)組,故這里僅列出了五次重復(fù)測數(shù)統(tǒng)計(jì)表.只要知道了數(shù)量指標(biāo),就可查知近似值.
例1 經(jīng)巴斯德消毒的牛奶樣品作10 0、10-1、10-2稀釋,每個(gè)稀釋度作五管重復(fù),每個(gè)重復(fù)管中加入1ml小份樣品接種,培養(yǎng)后,100五管均出現(xiàn)生長10-1有三管生長,而10-2沒有生長,其數(shù)量指標(biāo)為530,從表6-2查出近似值是7.9,則每毫升牛奶含活菌為：7.9×10個(gè).
例2 牛奶樣品作10-3、10-4、10-5稀釋,同上法各取五個(gè)1毫升小份稀釋的樣口接種,經(jīng)培養(yǎng),10-3有四管生長,10-4有兩管生長,而10-5沒有生長.其數(shù)量指標(biāo)為420.從表6-2查出近似值是2.2,由于數(shù)量指標(biāo)的第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)是1,000,故每毫升牛奶中含活菌為：2.2×10 3個(gè).此方法只有因某種原因不能使用瓊脂平皿菌落計(jì)數(shù)時(shí)才采用.
從前面可看出,活菌計(jì)數(shù)法盡管有一定的局限性,但它卻能提供其他方法不能獲得的資料,所以在食品、奶品、醫(yī)學(xué)及衛(wèi)生微生物學(xué)中經(jīng)常采用.為了消除上述方法的復(fù)雜性,現(xiàn)在不論是培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件或是稀釋方法、計(jì)算方法,以及結(jié)果分析和解釋等方面,通過多年的實(shí)踐,都制訂了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn).
如果測定量大而且含菌濃度很低樣品(如空氣、水等)中的活菌數(shù)時(shí),則應(yīng)將待測樣品通過微孔薄膜(如硝化纖維素薄)過濾濃庥,再與膜一起放到培養(yǎng)基或浸透了培養(yǎng)液的支持物表面培養(yǎng),然后根據(jù)菌藩數(shù)推知樣品含菌數(shù).
(三) 測定細(xì)胞物質(zhì)量
1.測定細(xì)胞總含氮量來確定細(xì)菌濃度 蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì),含量比較穩(wěn)定,而氮又是蛋白質(zhì)的重要組成.其方法要點(diǎn)：從一定量培養(yǎng)物中分離出細(xì)菌,洗滌,以除去培養(yǎng)基帶入的含氮物質(zhì).再用凱氏定氮法法測定總含氮量,以表示原生質(zhì)含量的多少.一般細(xì)菌的含氮量約為原生質(zhì)干重的14%.而總氮量與細(xì)胞蛋白質(zhì)總含量的關(guān)系可用下式計(jì)算：
蛋白質(zhì)總量=含氮量%×6.25
此法只適用于細(xì)胞濃度較高的樣品,同時(shí)操作過程也較麻煩,故主要用于科學(xué)研究.
2.DNA含量測定法 利用DNA與DABA-2HCl(即新配制的20%W/W,3,5-二氨基苯甲酸-鹽酸溶液)能顯示特殊熒光反應(yīng)的原理而設(shè)計(jì)的.將一定容積培養(yǎng)物的菌懸液,通過熒光反應(yīng)強(qiáng)度,求得DNA的含量,可以直接反映所含細(xì)胞物質(zhì)的量.同時(shí)還可根據(jù)DNA含量計(jì)算出細(xì)菌的數(shù)量.因?yàn)槊總€(gè)細(xì)菌平均含DNA8.4×10-5納克.
3.測定細(xì)胞干重法 單位體積培養(yǎng)物中,細(xì)胞的干重可用來表示菌體的生長量.將單位體積培養(yǎng)液中的菌體,以清水洗凈,然后放入干燥器內(nèi)加熱或減壓干燥.其菌體干重可直接用精密儀器測定.一般來說,細(xì)菌的干重約為濕重的20-25%,即1毫克干菌體=4-5毫克濕菌體=4-5×10 9個(gè)菌體.此法較為直接而又可靠,主要用于調(diào)查研究.但只適用于菌體濃度較高的樣品,而且要求樣品中不含非菌體的干物質(zhì).
4.基他生理指標(biāo)測定法 微生物新陳代謝的結(jié)果,必然要消耗或產(chǎn)生一定量的物質(zhì),以表示微生物的生長量.一般生長旺盛時(shí)消耗的物質(zhì)就多,或者積累的某種代謝產(chǎn)物也多.例如通過測定微生物對(duì)氧的吸收、發(fā)酵糖產(chǎn)酸量、或測定谷氨酸在氨基脫羧酶作用下產(chǎn)生CO2的多少來推知細(xì)菌生長情況.這是一種間接方法.使用時(shí)必須注意：作為生長指標(biāo)的那些生理活動(dòng)項(xiàng)目,應(yīng)不受外界其他因素的影響或干擾.
可以看出,每種方法都各有優(yōu)點(diǎn)和局限性.只有在考慮了這些因素同要著手解決的問題之間的關(guān)系以后,才能對(duì)具體的方法進(jìn)行選擇.正如前面說過的,平皿菌落計(jì)數(shù)法是微生物學(xué)中應(yīng)用最多的常規(guī)方法,掌握這一方法的原理和實(shí)際操作,很有必要.但此法在理論上僅能反映活細(xì)胞數(shù).另外,當(dāng)用兩種不同的方法測量細(xì)菌的生長量時(shí),其結(jié)果不一致是完全可能的,例如對(duì)靜止期培養(yǎng)物進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)時(shí)比平皿菌落計(jì)數(shù)法所得的數(shù)字高得多,因前者包括所有的活細(xì)胞與死細(xì)胞.而后者只能反映出活細(xì)胞數(shù).
測定微生物生長量,在理論研究和實(shí)際應(yīng)用中都十分重要.當(dāng)我們要對(duì)細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中或不同條件下的生長情況進(jìn)行評(píng)價(jià)或解釋時(shí),就必須用量的術(shù)語來表示生長.例如,可以通過細(xì)菌生長的快慢來判斷某一條件是否適合.生長快的條件,最終的細(xì)胞總收獲量可能沒有另一些條件下的收獲量大.在另一些條件下,生長速率雖然較低,但它卻可在一段較長的時(shí)間內(nèi)不斷增加.這種情況可用釁6-5表示.這是同一種菌在兩種不同的培養(yǎng)基上生長情況的比較.這種菌在兩種培養(yǎng)里都能生長.假如在A時(shí)測量生長,可以斷定在培養(yǎng)基Ⅱ里生長快；若在B時(shí)測量,則在兩種培養(yǎng)基上都生長得很好；可是在C時(shí)測量,卻在培養(yǎng)基Ⅰ里生長好些.據(jù)此,我們就可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇了.如果培養(yǎng)目的是要機(jī)體生長得早而快,就選用培養(yǎng)基Ⅱ；如果是要得到大量的細(xì)胞,就應(yīng)選用培養(yǎng)基Ⅰ.因此,只有具備了有關(guān)生長的定量方面的知識(shí),才能在實(shí)際應(yīng)用中作用正確的選擇,以利科研和生產(chǎn).
三、連續(xù)培養(yǎng)（詳細(xì)講解,讓學(xué)生理解并掌握）
將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中,經(jīng)過培養(yǎng)生長,最后一次收獲,此稱分批培養(yǎng)(batch culture).通過對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)的生長曲線的分析可知,在分批培養(yǎng)中,培養(yǎng)基一次加入,不予補(bǔ)充,不再更換.隨著微生物的活躍生長,培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗,有害代謝產(chǎn)物不斷積累,細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長期不可長時(shí)間維持.如果在培養(yǎng)器中不斷補(bǔ)充新鮮營養(yǎng)物質(zhì),并及時(shí)不斷地以同樣速度排出培養(yǎng)物(包括菌體及代謝產(chǎn)物),理論上講,對(duì)數(shù)生長期就可無限延長.只要培養(yǎng)液的流支量能使分裂繁殖增加的新菌數(shù)相當(dāng)于流出的老菌數(shù),就可保證培養(yǎng)器中總菌量基本不變.50年代出現(xiàn)的連續(xù)培養(yǎng)(continuous cultivation)技術(shù)就是據(jù)此原理而設(shè)計(jì)的,這種方法就叫連續(xù)培養(yǎng)法.連續(xù)培養(yǎng)方法的出現(xiàn),不僅可隨時(shí)為微生物的研究工作提供一定生理狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)材料,而且可提高發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效益和自動(dòng)化水平.此法已成為當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展方向.
最簡單的連續(xù)發(fā)酵裝置包括：培養(yǎng)室、無菌培養(yǎng)基容器以及可自動(dòng)調(diào)節(jié)流速(培養(yǎng)基流入,培養(yǎng)物流出)的控制系統(tǒng),必要時(shí)還裝有通氣、攪拌設(shè)備.連續(xù)培養(yǎng)裝置的一個(gè)主要參數(shù)是稀釋率(D),它的定義為：D=FV=流動(dòng)速率容積.控制連續(xù)培養(yǎng)的方法主要有兩種：