熒光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用來檢測基因的表達(dá)量的,但二者檢測的東西多少有些不同.熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入可以和雙鏈DNA特異性結(jié)合的熒光染料（sybr green）或者和目的DNA片段結(jié)合的熒光探針（taqman),通過監(jiān)控PCR過程中的熒光的變化,并且和某些管家基因的熒光變化進(jìn)行對比反應(yīng)出目標(biāo)基因的表達(dá)量.熒光定量PCR的主要有效數(shù)據(jù)是熒光信號增長到最大值的一半時的時間.半定量RT-PCR則是通過RT-PCR最終產(chǎn)物電泳后電泳條帶的明暗來間接反應(yīng)出原始模板的豐度.熒光定量PCR因為是全程監(jiān)控PCR擴(kuò)增的變化,并且能夠同管家基因的擴(kuò)增曲線進(jìn)行相對定量,而將基因的表達(dá)量數(shù)值化,準(zhǔn)確度高于半定量RT-PCR.半定量RT-PCR因為是監(jiān)控的最終產(chǎn)物,而在基因表達(dá)水平很高的時候,PCR體系很可能在反應(yīng)中后期就飽和了,所以對于高水平表達(dá)的基因來說,用半定量RT-PCR并不能很準(zhǔn)確的說明問題.但是如果要發(fā)表比較高檔次的論文的話,某些變態(tài)的老外審稿并不認(rèn)可單一的熒光定量PCR的結(jié)果,他們會同時需要作者做一個半定量RT-PCR來作為輔助證明.
半定量RT-PCR的引物和熒光定量PCR的引物設(shè)計原則并不是一樣的,換而言之,二者的引物并不是可以通用的.所以退火溫度自然是不同的,具體怎么不同,要根據(jù)實際用到的引物去算.