黑膠蟲
1、 黑膠蟲概況:
在細(xì)胞培養(yǎng)的時候,有時會在400倍顯微鏡下看到小黑點(diǎn)在動,小黑點(diǎn)有時呈點(diǎn)狀,有時呈小的片狀,運(yùn)動形式為在原地振動(類似布朗運(yùn)動),這種小黑點(diǎn)既不是細(xì)菌、霉菌,也不是支原體(我們曾經(jīng)請周守長用血平板培養(yǎng)過,沒有菌落出現(xiàn)),目前業(yè)內(nèi)人士稱其為“黑膠蟲”.
黑膠蟲到底是否為生物?這個一直是業(yè)內(nèi)人士的疑惑.黑膠蟲一般是存在血清里的,而血清通常是經(jīng)過0.1μm濾膜過濾的,所以血清里不可能存在細(xì)菌、霉菌及支原體等微生物.如果說黑膠蟲不是生物,它會不斷增多,達(dá)到一定數(shù)量時會與細(xì)胞競爭性生長,與細(xì)胞競爭培養(yǎng)基中的營養(yǎng),從而使得細(xì)胞營養(yǎng)不足而死亡.
不管對于黑膠蟲的爭論如何,但有幾個是目前大家公認(rèn)的:
① 與細(xì)胞競爭性生長,對細(xì)胞生長有不利影響.
② “黑膠蟲”會增殖,增殖多時,視野下一大片都為“黑膠蟲”.
③ “黑膠蟲”與血清有關(guān),與血清質(zhì)量有很大關(guān)系.
2、目前對“黑膠蟲”的定論:有2種解釋:
第一, 黑膠蟲為生物.它是小于細(xì)菌的生物,直徑小于0.1μm,大多國外血清中多見,可能是國外牛血清中含有的某種原蟲.只要它是生物,那么在培養(yǎng)基中一定會對細(xì)胞有影響.
第二, 黑膠蟲不是生物.國內(nèi)的血清中,通常滅活之后都會有絮狀沉淀出現(xiàn),而黑膠蟲出現(xiàn)時,所使用的血清被反復(fù)凍融過多次.所以推測,所謂的“黑膠蟲”其實(shí)就是血清中的某些蛋白成分的物質(zhì),經(jīng)過滅活之后喪失活性,在培養(yǎng)基中,鏡檢見到的運(yùn)動其實(shí)是這些物質(zhì)在溶液中做“布朗運(yùn)動”.隨著細(xì)胞消耗培養(yǎng)基,這些物質(zhì)越來越多,最后細(xì)胞所用的營養(yǎng)消耗完,細(xì)胞容易死亡.
3、對于“黑膠蟲”的處理方法:
首先,血清買回來滅活前凍融應(yīng)逐級凍融,即按照-20℃——4℃完全融化后,再置入水浴中,與室溫一起升高到56度,這樣的目的是避免溫度驟變,導(dǎo)致血清中的營養(yǎng)物質(zhì)喪失活性.
第二,血清滅活后分裝保存.按照每次用血清的量分裝,盡量減少血清凍融的次數(shù).分裝時注意無菌.
第三,細(xì)胞培養(yǎng)時血清濃度稍大一些.通常細(xì)胞培養(yǎng)血清濃度為10%-15%,但如果血清凍融次數(shù)過多,那營養(yǎng)物質(zhì)喪失活性,按15%的濃度配制事實(shí)上達(dá)不到15%的營養(yǎng)成分,故培養(yǎng)基配置時一般用18%-20%的血清.
這種黑膠蟲,在國外稱其為- 納米細(xì)菌,現(xiàn)將我看到的一些資料轉(zhuǎn)述如下,希望對大家有所幫助:
1.納米細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)
芬蘭的一個科學(xué)家Ciftcioglu et al 在其細(xì)胞培養(yǎng)過程中, 發(fā)現(xiàn)在胎牛血清中存在一種直徑50-500 nm的微粒; 這種顆粒物對伽瑪射線具有很強(qiáng)的耐受性; 針對包括支原體在內(nèi)的所有已知微生物的特異性檢測實(shí)驗(yàn)均為陰性; 這種顆粒物在血瓊脂培養(yǎng)基以及支原體培養(yǎng)基中無法生長, 通常的細(xì)菌染色方法難以著色. 因此, Kajander判定這是一種新的微生物, 根據(jù)其體型微小并且棲息在血液中的特點(diǎn), 將其命名為Nanobacterium sanguineum, 簡稱Nanobacteria, 中文譯名納米細(xì)菌, 并將菌種保存于德國微生物存儲中心 (DSM No: 5819-5821, the GermanCollection of Micro-organisms, Braunschweig, Germany).
2 納米細(xì)菌的生物學(xué)特性
2.1 納米細(xì)菌——哺乳動物體內(nèi)最小的細(xì)菌 細(xì)胞培養(yǎng)時所使用的血清通常采用過濾法達(dá)到無菌的目的, 通常采用直徑0.1 μm的濾膜過濾除菌. Kajander研究發(fā)現(xiàn), 0.1 μm
的濾膜過濾并不能有效地清除血清中的納米細(xì)菌, 但是血清經(jīng)過0.05 μm的濾膜過濾則能有效清除納米細(xì)菌污染. 細(xì)胞培養(yǎng)條件下的納米細(xì)菌經(jīng)過0.2 μm的濾膜過濾后約有3%的納米細(xì)菌可以通過濾膜, 而在加壓過濾的情況下, 約有50%的納米細(xì)菌可以通過0.2 μm的濾膜. 剛剛經(jīng)過過濾的納米細(xì)菌在相差顯微鏡下無法發(fā)現(xiàn), 但在不含血清添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后, 即可以用相差顯微鏡觀測到. 電子顯微鏡觀察顯示, 納米細(xì)菌的平均直徑為200 nm, 而子代納米細(xì)菌的最小直徑僅50 nm. 傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為, 只有當(dāng)細(xì)胞直徑在不低于140 nm時, 才能維持其最基本的新陳代謝. Kajander認(rèn)為, 納米細(xì)菌可能是地球形成早期、在原始大氣條件下的一種最原始的生命形式, 因此不能用衡量已經(jīng)經(jīng)過幾十億年進(jìn)化的生命形式的觀點(diǎn)去衡量這種古老的生命形式, 并且推測, 納米細(xì)菌遭受不良因素的侵害后可以形成許多的體形微小的碎片, 并將其釋放到環(huán)境中, 每一個碎片都可能攜帶部分遺傳信息, 在特定條件下, 這些"基本"顆粒聚集在一起形成群落, 當(dāng)足夠數(shù)量的"基本"顆粒提供完整的遺傳信息時, 則可以形成新的納米細(xì)菌.
2.2 納米細(xì)菌緩慢的增殖周期
微生物學(xué)家通常是通過對某種微生物進(jìn)行培養(yǎng), 進(jìn)而了解該種微生物的特性. 然而, 并非每種微生物都是可以在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)的,主要原因在于這些微生物的培養(yǎng)條件我們并不清楚, 其生存環(huán)境以及是否與其他微生物存在共生關(guān)系我們并不十分了解. 納米細(xì)菌就是一種對生長環(huán)境要求非??量痰奈⑸? 其新陳代謝率極為緩慢, 僅為普通細(xì)菌的1/10 000. 研究發(fā)現(xiàn), 納米細(xì)菌主要利用環(huán)境中的氨基酸而不是葡萄糖來提供能量, 谷氨酰胺、天冬酰胺以及精氨酸均可被其利用. 在37 ℃有50-10 mL/L的二氧化碳及900-950 mL/L的空氣存在的潮濕環(huán)境下, 并且在含有100 mL/L胎牛血清和適量谷氨酰胺的pH值7.4的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 納米細(xì)菌能夠緩慢生長, 平均倍增時間為3 d,而在無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中, 其增殖速度變慢, 細(xì)菌倍增時間可延長至5-6 d, 在添加適量促納米細(xì)菌生長因子BGF(一種桿菌培養(yǎng)上清的超濾液)或N3(納米細(xì)菌培養(yǎng)上清的超濾液)的條件下, 其增殖速度加快, 倍增時間可縮短至0.6-1 d. 在有促納米細(xì)菌生長因子BGF存在的條件下, 納米細(xì)菌甚至可以在固體培養(yǎng)基中生長, 并形成直徑l mm大小的細(xì)菌集落.
2.3 納米細(xì)菌獨(dú)特的生物礦化現(xiàn)象
當(dāng)在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納米細(xì)菌被轉(zhuǎn)移至不含血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)時 (DMEM或RPMI-1640), 在1 a之內(nèi)就可以觀察到納米細(xì)菌出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象, 在1 wk之內(nèi), 就可以在納米細(xì)菌的周圍形成幾微米厚的生物被膜 (biofilm), 并且緊緊貼附于培養(yǎng)瓶底部, 而納米細(xì)菌棲息其中(這與在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的納米細(xì)菌的形態(tài)明顯不同), 此時其大小接近于一個酵母細(xì)胞, 2-3 wk以后, 由于生物被膜的增厚, 其直徑已近似于一個紅細(xì)胞的大小. 用EDX法對這種生物被膜的化學(xué)組成進(jìn)行分析, 顯示其鈣磷的峰值與羥基磷灰石極其相似, 電子顯微鏡觀察以及傅立葉轉(zhuǎn)換紅外頻譜(fourier transform IR spectroscopy, FTIR)分析顯示其主要成分為碳酸羥基磷灰石(carbonate hydroxyapatite), 而且,不論在有無血清作為添加劑的情況下, 都可以見到這種被羥基磷灰石包繞的納米細(xì)菌, 這種情況甚至可以在處于分裂期的納米細(xì)菌中見到. 納米細(xì)菌并不產(chǎn)生尿激酶和堿性磷酸酶, 并且即便經(jīng)過長達(dá)數(shù)周的培養(yǎng), 其培養(yǎng)基的pH值也不會出現(xiàn)明顯的變化, 一直穩(wěn)定在7.4左右, 這表明在納米細(xì)菌細(xì)胞膜表面所生成的羥基磷灰石結(jié)晶是源自于生物大分子的, 即生物礦化現(xiàn)象, 而并非是由于pH值改變所導(dǎo)致的簡單的物理結(jié)晶現(xiàn)象.納米細(xì)菌利用培養(yǎng)體系中的鈣、磷合成羥基磷灰石作為其生物被膜的主要成分, 這種生物礦化過程受到生長環(huán)境中某些因素的調(diào)控, 從而使其呈現(xiàn)不同的外觀, 如羥基磷灰石形、細(xì)菌被膜形、沙粒形、結(jié)石形和類似腫瘤的外形. (這也許就是國內(nèi)的一些研究者們認(rèn)為其是一些磷酸鹽類的無機(jī)物的部分原因吧!).在含有新鮮血清的培養(yǎng)基中納米細(xì)菌的生物礦化現(xiàn)象程度較輕微, 這是由于血清中含有強(qiáng)效羥基磷灰石合成抑制因子, 骨鈣素 (osteocalcin) 和胎球蛋白(fetuin), 由于這些抑制蛋白的存在, 所以在有血清存在的情況下, 納米細(xì)菌的生物礦化作用受到明顯抑制. 當(dāng)血清濃度降低時, 納米細(xì)菌的生物礦化現(xiàn)象增強(qiáng), 在不含血清的培養(yǎng)體系中, 生物礦化現(xiàn)象劇烈而迅速. 盡管改良的Loeffler固體培養(yǎng)基中含有750 mL/L血清成分, 但血清蛋白成分在滅菌過程中受到破壞, 所以在此培養(yǎng)基中的納米細(xì)菌的礦化作用并不受抑制, 在此培養(yǎng)基中生長的納米細(xì)菌其菌落直徑可達(dá)1-5 mm. 另外, 當(dāng)有乙二胺四乙酸(EDTA)存在時, 納米細(xì)菌的生物現(xiàn)象會受到明顯的抑制.由于礦化生物被膜的保護(hù)作用以及極其緩慢的新陳代謝率, 使納米細(xì)菌能夠耐受各種不利的物理?xiàng)l件和化學(xué)損傷因素以及多種抗生素的打擊.
2.4納米細(xì)菌的檢測方法 由于納米細(xì)菌在標(biāo)準(zhǔn)微生物培養(yǎng)基中無法生長, 并且即便是在最適宜其生長的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中, 納米細(xì)菌的生長也極為緩慢, 其新陳代謝率僅為普通細(xì)菌的萬分之一, 這使得許多基于檢測細(xì)菌新陳代謝的微生物學(xué)方法無法檢測納米細(xì)菌的存在. 由于納米細(xì)菌難以用傳統(tǒng)的火焰法和乙醇法固定, 并且大多數(shù)染料無法穿透其細(xì)胞壁, 而且不能用普通顯微鏡對其進(jìn)行觀察, 因此常規(guī)的細(xì)菌學(xué)染色法并不能檢測到納米細(xì)菌的存在. 通過Kajander et al 的研究, 發(fā)現(xiàn)70℃干烤10 min, 可以將其有效固定; 另外, 用茜素紅S、剛果紅以及硝酸銀染料可以使納米細(xì)菌著色; 而培養(yǎng)狀態(tài)下的納米細(xì)菌可以在放大400倍的相差顯微鏡下清晰地觀察其生長情況; 用DNA熒光染料 (Dapi或Hoechst) 按普通細(xì)菌DNA染色的條件對納米細(xì)菌DNA進(jìn)行染色均不成功, 而當(dāng)按照線粒體DNA以及病毒DNA染色條件, 對納米細(xì)菌DNA進(jìn)行染色時, 熒光顯微鏡下可以觀察到特征性的熒光; 用納米細(xì)菌特異性抗體進(jìn)行熒光染色也可以清晰地顯示納米細(xì)菌的存在; 利用電子顯微鏡對經(jīng)過負(fù)染的納米細(xì)菌進(jìn)行觀察, 可以清晰的顯示80-350 nm大小、單獨(dú)或聚集成簇的納米細(xì)菌以及其表面的生物被膜(biofilm)結(jié)構(gòu); 而用透射電鏡對納米細(xì)菌的超薄切片進(jìn)行觀察, 可以清晰的顯示其內(nèi)部結(jié)構(gòu).
可以發(fā)現(xiàn)如下的特點(diǎn):
(1) 與細(xì)胞共生,細(xì)胞長的好或密度大的話,小黑點(diǎn)就少,反之則 多;
(2) 對抗生素?zé)o效;
(3) 可能通過培養(yǎng)箱空氣進(jìn)行污染;
(4) 單用培養(yǎng)液及血清培養(yǎng)沒發(fā)現(xiàn)問題.
(5) 換掖沖洗后也無效.
以下是論壇里我找來的相關(guān)帖子內(nèi)容
“黑膠蟲”是近十幾年才發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞污染物,“黑膠蟲”的分類目前尚無鑒定確認(rèn).
“黑膠蟲”可寄生于動物細(xì)胞,也可以生存于培養(yǎng)基中,依靠細(xì)胞和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)為生,并隨細(xì)胞傳代而傳代.“黑膠蟲”與細(xì)胞競爭性生長,開始時對細(xì)胞并沒有什么影響,但當(dāng)黑膠蟲的數(shù)量多到一定程度的時候, 細(xì)胞生長就會受到影響直至死亡,嚴(yán)重影響了科研活動的開展和進(jìn)行.所以“黑膠蟲”的污染常在培養(yǎng)條件改變、細(xì)胞接種密度降低、細(xì)胞狀態(tài)不佳時顯現(xiàn)并使實(shí)驗(yàn)中斷,尤其在凍存細(xì)胞復(fù)蘇時可造成大量細(xì)胞死亡.
目前比較公認(rèn)的觀點(diǎn)認(rèn)為“黑膠蟲”是一種微生物,增殖緩慢但對細(xì)胞有損害,數(shù)量達(dá)到一定程度可引起細(xì)胞死亡,其來源可能是細(xì)胞本身的污染或從動物取材時污染造成的.該污染在全世界細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室中普遍存在,解決該問題是一個世界性難題
關(guān)于是什么的問題的討論
A. 玻璃培養(yǎng)瓶中的類似氧化硅的東西(曾經(jīng)有文獻(xiàn)報道過)
B. 據(jù)說這是黑膠蟲,又有人說是原生動物,好象也沒個統(tǒng)一的說法
C. 據(jù)病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲,似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處,然而由于課題經(jīng)費(fèi)不夠而不能繼續(xù)進(jìn)行下去.
D. 有人說是納米級的細(xì)菌
其他的特點(diǎn)
(1)形態(tài)上有些像細(xì)菌,直徑約在0.5~1微米,
(2) 在400X倒置顯微鏡小,有典型的布朗運(yùn)動(不規(guī)則的原地小距離抖動).
(3) 細(xì)胞內(nèi)好像也有存在,
(4) 但并不引起培養(yǎng)液混濁
(5) 時間稍長,細(xì)胞狀態(tài)明顯惡化,并最后死亡
大家的處理:
1.換好一點(diǎn)的血清(我覺著和血清的關(guān)系不大).
2.如果是貼壁細(xì)胞的話,可用無菌的PBS洗幾次,可一定程度上緩解.若是懸浮的話,就不太好處理拉,可以向其中少加一點(diǎn)滋養(yǎng)細(xì)胞(從小鼠腹腔內(nèi)取的巨噬細(xì)胞,這種細(xì)胞不分裂,過一陣就死掉了,做抗體雜交瘤融合的同志肯定知道).加滋養(yǎng)細(xì)胞對有黑膠蟲的剛復(fù)蘇的細(xì)胞很有效!還有就是實(shí)驗(yàn)環(huán)境要注意好,保持細(xì)胞間整個環(huán)境的潔凈度.
3.換用進(jìn)口的一次性塑料培養(yǎng)瓶.
4.建議清理無菌室所有物品,重新滅菌,用KMnO4熏蒸,按首次使用無菌室做,細(xì)胞重新復(fù)蘇,.
5. 在換液前先加入生理鹽水并輕輕拍打,沖洗干凈后再加入培養(yǎng)液,堅(jiān)持天天洗,傳代時加生理鹽水再離心一次,接種密度稍大一些,一段時間后,蟲子就會大大減少,對細(xì)胞的生長也不會有大的影響.
6.有材料稱minocycline具有一定的作用,可以和換液結(jié)合起來使用.
細(xì)胞污染問題
細(xì)胞污染問題
我的細(xì)胞在高倍鏡下觀察有很多會動的小蟲,但是培養(yǎng)基不變渾濁,也不影響細(xì)胞生長,低倍鏡下看不到小蟲,但是發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有很多小東西,這是什么污染啊?
400倍才能看到動,不是貼壁動,而是在培養(yǎng)基中懸浮著游動
我的細(xì)胞在高倍鏡下觀察有很多會動的小蟲,但是培養(yǎng)基不變渾濁,也不影響細(xì)胞生長,低倍鏡下看不到小蟲,但是發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有很多小東西,這是什么污染啊?
400倍才能看到動,不是貼壁動,而是在培養(yǎng)基中懸浮著游動
生物人氣:558 ℃時間:2020-06-23 09:15:03
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