抗體的純化 ( 硫酸銨沉淀法）
一,基本原理
硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質.用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離,是免疫球蛋白分離的常用方法.高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子,從而破壞蛋白質表面的水化膜,降低其溶解度,使之從溶液中沉淀出來.各種蛋白質的溶解度不同,因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質.這種方法稱之為鹽析.鹽濃度通常用飽和度來表示.硫酸銨因其溶解度大,溫度系數小和不易使蛋白質變性而應用最廣.
二,試劑及儀器
1 .組織培養(yǎng)上清液、血清樣品或腹水等
2.硫酸銨（ NH 4 ） SO 4
3.飽和硫酸銨溶液（ SAS ）
4.蒸餾水
5.PBS( 含 0.2g /L 疊氮鈉 )
6.透析袋
7.超速離心機
8.pH 計
9.磁力攪拌器
三,操作步驟
以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來介紹抗體的硫酸銨沉淀.各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸 銨的飽和度也不完全相同.通常用來分離抗體的硫酸銨飽和度為 33% — 50% .
（一）配制飽和硫酸銨溶液（ SAS ）
1.將 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 邊攪拌邊慢慢加到 1 升 蒸餾水中.用氨水或硫酸調到硫酸pH7.0 .此即飽和度為 100% 的硫酸銨溶液（ 4.1 mol/L,25 ° C ）.
2.其它不同飽和度銨溶液的配制
（二）沉淀
1.樣品（如腹水） 20 000 ′ g 離心 30 min ,除去細胞碎片；
2.保留上清液并測量體積；
3.邊攪拌邊慢慢加入等體積的 SAS 到上清液中,終濃度為 1 ：1 （
4.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時或攪拌過夜（ 4 ° C ）,使蛋白質充分沉淀.
（三）透析
1.蛋白質溶液 10 000 ′ g 離心 30 min （ 4 ° C ）.棄上清保留沉淀；
2.將沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 疊氮鈉中.沉淀溶解后放入透析袋對
PBS -0.2g /L 疊氮鈉透析 24-48 小時（ 4 ° C ）,每隔 3-6 小時換透析緩沖液一次,以徹底除去硫酸氨；
3.透析液離心,測定上清液中蛋白質含量.
四,應用提示
（一） 先用較低濃度的硫酸氨預沉淀,除去樣品中的雜蛋白.
1.邊攪拌邊慢慢加 SAS 到樣品溶液中,使?jié)舛葹?0.5:1 (v/v) ；
2.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時 或過夜（ 4 ° C ）；3.3000 ′ g 離心 30 min （ 4 ° C ）,保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ,再次離心得到沉淀.將沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨；
4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ,再次離心得到沉淀.將沉淀溶于 PBS ,同前透析,除去硫酸氨；
5.雜蛋白與欲純化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差別很大時,用預沉淀除雜蛋白是非常有效
（二）為避免體積過大,可用固體硫酸氨進行鹽析（硫酸氨用量參考表 1 ）；硫酸氨沉淀法與層析 技術結合使用,可得到更進一步純化的抗體.